Depuis les années 1990, l’étude des tissus adipeux a permis de caractériser les propriétés endocrines et immunomodulatoires de cet organe. Les avancées récentes de la recherche concernant la biologie du tissu adipeux ont révélé de nouveaux paradigmes auparavant inexplorés qui pourraient favoriser notre compréhension de la nature biologique du tissu adipeux, mais également le développement de nouvelles applications thérapeutiques ou cliniques. De nouveaux concepts ont récemment émergé sur le tissu adipeux, notamment en ce qui concerne : 1) sa densité; et 2) sa plasticité. Dans la présente thèse, nous avons caractérisé ces deux concepts.
Chez l’humain, la quantité et la distribution du tissu adipeux mesurées par tomographie axiale sont des paramètres fréquemment utilisés pour évaluer le risque cardiométabolique. La tomographie axiale permet également de mesurer la densité radiologique du tissu adipeux. Jusqu’à présent, peu d’études se sont intéressées à ce paramètre, mais il a été proposé que la densité radiologique du tissu adipeux soit le reflet de la qualité de celui-ci (282). D’un point de vue biologique, nous ne savons pas ce que représente la densité radiologique. D’autre part, la relation entre les valeurs de densité radiologique du tissu adipeux et la composition de celui-ci, de même que l’association entre les valeurs de densité radiologique et les fonctions biologiques du tissu adipeux sont incomprises. Ainsi, il ne fait aucun doute qu’il est important de déterminer ce que reflète la densité radiologique du tissu adipeux.
Par ailleurs, le tissu adipeux est composé de différents types cellulaires et il est doté d’une grande plasticité. De façon générale le terme « plasticité » désigne la capacité des cellules du tissu adipeux à moduler leur phénotype et à s’adapter aux différentes situations métaboliques (283). Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés aux cellules souches de la FSV du tissu adipeux. Nous savons que les ASCs contenues dans le tissu adipeux se situent à différents stades sur le continuum de la différenciation et que leur devenir cellulaire est influencé par différents facteurs. Leur plasticité fait en sorte qu’elles peuvent acquérir différents phénotypes (284). À ce jour, la caractérisation des ASCs n’est pas exhaustive et nous croyons qu’il est nécessaire de pouvoir les caractériser et les identifier pour qu’elles puissent être utilisées à des fins thérapeutiques. Les adipocytes du tissu adipeux détiennent également des propriétés plastiques car ils peuvent moduler leur nombre et leur grosseur en fonction de la situation métabolique (285). D’autre part, les adipocytes matures peuvent se dédifférencier pour donner naissance à des cellules d’aspect fibroblastique possédant les caractéristiques des cellules souches. Les mécanismes cellulaires
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associés à la dédifférenciation sont incompris, mais certaines études laissent croire que la division cellulaire pourrait être impliquée (170, 171, 226). Par ailleurs, une étude publiée préalablement dans notre laboratoire a suggéré un rôle de la MEC dans ce processus (123). La dédifférenciation est un exemple de plasticité peu connu. La découverte de ce processus a soulevé un intérêt pour le domaine de la médecine régénérative. Pour que les adipocytes dédifférenciés puissent être utilisés à des fins thérapeutiques, il est primordial de pouvoir les distinguer et les caractériser. Qui plus est, les mécanismes cellulaires menant à la dédifférenciation in vitro et in vivo demeurent incertains. Peu de groupes de recherche ont examiné le processus sous un aspect longitudinal et ont tenté d’en modifier l’efficacité. Il ne fait aucun doute que ce processus doit être caractérisé davantage.
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Objectifs et hypothèses
Conceptuellement, de nouveaux paradigmes ont récemment émergé en ce qui concerne nos connaissances sur le tissu adipeux, notamment en ce qui a trait à : 1) sa densité; et 2) sa plasticité. L’objectif général des travaux était de caractériser les phénomènes entourant la densité et la plasticité du tissu adipeux. Nous avons émis l’hypothèse générale que les phénomènes de densité et de plasticité du tissu adipeux reflètent des processus biologiques précis qui ont leurs racines dans le cycle de vie de l’adipocyte, notamment l’expansion hypertrophique, la prolifération et la différenciation cellulaire, ainsi que la dédifférenciation des adipocytes matures.
Les chapitres de cette thèse sont séparés en deux grandes sections. Chaque objectif spécifique correspond à un chapitre de la présente thèse.
Objectifs spécifiques
Section 1. Étude de la densité radiologique du tissu adipeux en lien avec la taille adipocytaire et les altérations métaboliques
Chapitre 1: Ce chapitre vise à examiner le potentiel de l’atténuation radiologique et de la surface
des tissus adipeux, deux mesures dérivées de la tomographie axiale, à prédire l’hypertrophie des adipocytes et les altérations métaboliques qui y sont reliées. Nous émettons l’hypothèse que les variations du risque cardiométabolique associé à l’hypertrophie des adipocytes viscéraux peuvent être expliqué en grande partie par les mesures dérivées de la tomographie axiale, c’est-à-dire la densité radiologique et la surface des tissus adipeux.
Section 2. La plasticité des cellules du tissu adipeux : caractérisation des cellules précurseurs de la FSV et étude du processus de dédifférenciation des adipocytes matures
Chapitre 2: Le deuxième chapitre a pour objectif d’identifier et de caractériser les cellules
précurseurs contenues dans la FSV du tissu adipeux chez la souris. Comme le marqueur CD38 est utilisé fréquemment pour déterminer le stade d’engagement des cellules souches hématopoïétiques, nous émettons l’hypothèse que ce marqueur pourrait être utilisé pour déterminer les cellules souches de la FSV qui sont engagées dans la différenciation adipogénique.
Chapitre 3 : L’objectif du troisième chapitre de cette thèse est de : 1) caractériser les changements d’expression génique qui surviennent au cours de la dédifférenciation des adipocytes matures
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humains en utilisant des puces à ADN; 2)classifier les gènes de façon hiérarchique en fonction des
différences d'expression entre les différents temps au cours du processus de dédifférenciation; et 3)
identifier les voies métaboliques surreprésentées parmi les gènes différentiellement exprimés. Nous
émettons l’hypothèse que la dédifferenciation est associée à une diminution de l’expression des gènes associés aux fonctions de l’adipocyte mature, ainsi qu’à une augmentation de l’expression des gènes associés au cycle cellulaire, à la reprogrammation cellulaire et à la MEC.
Chapitre 4 : Le quatrième chapitre de cette thèse a pour objectif : 1) d’appliquer un nouveau
modèle de culture cellulaire inversée permettant de dédifférencier les adipocytes matures humains et de moduler le processus à l’aide de différents traitements; 2) d’utiliser ce nouveau modèle de culture cellulaire inversée pour cibler et moduler le sentier métabolique du TGF-β; et 3) d’examiner les effets du sentier métabolique du TGF-β sur l’expression génique différents types de collagène durant la dédifférenciation des adipocytes. Puisque l’expression de plusieurs gènes associés à la MEC était modulée à la hausse durant la dédifférenciation des adipocytes dans les expériences menées au Chapitre 3, nous émettons l’hypothèse que le sentier métabolique du TGF-β joue un rôle important dans la modulation de l’expression des molécules de collagène durant la dédifférenciation des adipocytes.
Chapitre 5 : Le dernier chapitre de cette thèse a pour objectif de caractériser les mécanismes
cellulaires impliqués dans la dédifférenciation des adipocytes matures humains in vitro. Tel que proposé précédemment par certains auteurs, nous émettons l’hypothèse que les adipocytes matures ensemencés en culture cellulaire inversée peuvent se diviser pour donner naissance à des cellules de type fibroblastique.
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Méthodologie
Recrutement des participants, échantillons de tissus adipeux, mesures de la masse grasse et de la distribution des graisses
Pour réaliser l’étude contenue dans le Chapitre 1 de cette thèse, nous avons recruté des femmes en bonne santé âgées entre 35 et 70 ans admises pour une chirurgie gynécologique élective au Centre hospitalier universitaire de Québec (CHU de Québec) entre 2001 et 2012. Ces femmes couvraient le spectre d’adiposité de minces à obèses. Les femmes ont été recrutées au moment de leur rendez- vous préopératoire quelques semaines avant leur chirurgie. Les femmes prenant une médication pouvant affecter certains paramètres métaboliques (β-bloqueurs, inhibiteurs du système rénine- angiotensine, statines et fibrines) n’étaient pas inclues dans cette étude. Celles ayant rapporté l’utilisation d’anti-inflammatoires non stéroïdiens quelques semaines avant la chirurgie étaient également exclues, ainsi que celles souffrant de diabète, d’un problème thyroïdien non contrôlé, du Syndrome de Cushing ou d’un cancer. Le matin-même de la chirurgie ou quelques semaines avant, des informations concernant l’histoire reproductive et menstruelle, la prise de médicaments, ainsi que les antécédents médicaux étaient recueillis. Le statut de ménopause était documenté à l’aide d’un questionnaire (informations concernant les dernières règles, les cycles menstruels, ainsi que les niveaux de FSH). Des mesures anthropométriques (poids, taille, tour de taille), ainsi que des examens radiologiques (absorptiométrie aux rayons X pancorporelle) étaient effectués le matin- même de la chirurgie ou quelques jours avant celle-ci. Une tomographie axiale était également effectuée pour caractériser la distribution des graisses au niveau abdominal. Le jour de la chirurgie, un échantillon de sang à jeun, ainsi que deux échantillons de tissus adipeux étaient recueillis. Un premier échantillon était prélevé au niveau du site d’incision, correspondant au tissu adipeux sous- cutané et un autre échantillon était prélevé au niveau de la portion distale du grand omentum, représentant le tissu adipeux omental. Un bilan lipidique complet était obtenu et les niveaux de glucose et d’insuline à jeun étaient mesurés dans les échantillons de plasma. L’indice HOMA-IR était également calculé. Enfin, les concentrations plasmatiques d’adipokines (par exemple l’IL-6, l’adiponectine, la leptine et le TNF-α) étaient mesurées par ELISA.
Les expériences du Chapitre 2 ont été effectuées à partir des tissus adipeux inguinal, épidydimal et inter-scapulaire de souris mâles C57BL/6J (Harlan Laboratories) âgées de 8 semaines.
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Les échantillons de tissu adipeux sous-cutané et omental ayant servi pour les expériences de culture cellulaire inversée des Chapitres 3, 4 et 5 ont été obtenus chez des participants (hommes et femmes) sévèrement obèses admis pour une chirurgie bariatrique (dérivation biliopancréatique avec commutation duodénale, gastrectomie pariétale ou Roux-en-Y) à l’Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec (IUCPQ). Aucun examen radiologique n’a été effectué pour ces patients, mais nous avons obtenu quelques données anthropométriques (IMC et tour de taille). Par ailleurs, l’histoire clinique et les caractéristiques des patients ont été documentées selon des procédures habituelles.
Expériences effectuées avec les échantillons de tissus adipeux
Les échantillons de tissus adipeux humains ont été utilisés pour la mesure de la taille adipocytaire (Chapitre 1) et pour la culture cellulaire inversée (Chapitres 3, 4 et 5). Brièvement, une première partie des échantillons de tissus adipeux a été digérée à la collagénase de type I dans une solution physiologique de Krebs-Ringer-Henseleit (KRH) pour séparer la FSV et les adipocytes matures par flottaison (286). Les préadipocytes ont été isolés de la FSV par centrifugation. Le diamètre adipocytaire moyen a été mesuré à partir de la suspension d’adipocytes matures dans chacun des dépôts adipeux (Chapitre 1). Par ailleurs, les adipocytes matures ont été ensemencés en culture cellulaire inversée pour les expériences de dédifférenciation (Chapitres 3, 4, 5). Pour chaque patient, une partie de l’échantillon de tissus adipeux a été rapidement congelée et une autre partie a été fixée à la formaline, enrobée dans la paraffine, coupée au microtome et déposée sur une lame. Dans le cadre du Chapitre 2, les échantillons de tissus adipeux murins ont été utilisés pour des expériences de culture cellulaire et de cytométrie en flux. Brièvement, les adipocytes matures et la FSV ont été séparés par une digestion à la collagénase. Les préadipocytes ont été isolés à partir de la FSV pour effectuer des expériences de culture primaire et la différenciation adipogénique a été induite. Les populations d’ASCs CD34+, CD45- et CD31- CD38+ ou CD38- ont été triées par
cytométrie en flux et mises en culture pour tester leur potentiel de prolifération et de différenciation adipogénique. Nous avons également effectué des mesures d’expression génique par RT-PCR quantitatif sur les populations d’ASCs CD38+ et CD38- obtenues suite à un tri cellulaire.
En ce qui concerne les expériences contenues dans le Chapitre 3, l’ARN a été extrait à différents temps au cours du processus de dédifférenciation et le niveau d’expression des gènes a été mesuré en utilisant des puces à ADN. Nous avons également mesuré l’abondance du messager des gènes
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d’intérêt par RT-PCR en temps réel dans les cellules adipeuses en cours de dédifférenciation. Dans le cadre du Chapitre 4, nous avons aussi mesuré l’abondance du messager des gènes d’intérêt par RT-PCR en temps réel dans les échantillons de tissus adipeux entiers, dans la FSV, dans les adipocytes matures, ainsi que dans les cellules en cours de dédifférenciation.
Dans le cadre du Chapitre 5, nous avons effectué des expériences de microscopie en temps réel afin d’étudier les mécanismes cellulaires de la dédifférenciation. Nous avons également procédé à des expériences d’immunofluorescence sur les adipocytes en cours de dédifférenciation.
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