Étude du rôle physiologique et pathologique de la
famille miR-132/212 dans le cerveau
Thèse
Sara Rainone
Doctorat en neurobiologie
Philosophiæ doctor (Ph. D.)
Étude du rôle physiologique et
pathologique de la famille miR-132/212
dans le cerveau
Thèse
Sara Rainone
Sous la direction de :
RÉSUMÉ
La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus fréquente dans le monde. Au niveau microscopique, le cerveau des patients atteints par la MA présente deux principales caractéristiques pathologiques : les plaques amyloïdes, constituées d'agrégats du peptide Aβ (Amyloïde Bêta), et les dégénérescences neurofibrillaires, formées par des agrégats de la protéine Tau anormalement hyperphosphorylée. Parmi les facteurs endogènes qui pourraient participer à la progression de la MA, il y a les microARNs (miRs). Les miRs sont des petits ARNs non codants qui régulent l’expression de gènes cibles au niveau post-transcriptionnel. En particulier, la famille miR-132/212 est fortement régulée à la baisse dans le cerveau des patients atteints de la MA. Des études précédentes ont démontré que, chez la souris 3xTg-AD, un modèle de la MA, la délétion génétique de la famille miR-132/212 conduit à une augmentation de la phosphorylation et de l’agrégation de la protéine Tau, les deux mécanismes présumés à la base de la formation des dégénérescences neurofibrillaires.
En dehors de son rôle dans la MA, la famille miR-132/212 est également impliquée dans plusieurs troubles neurologiques. Notamment, son niveau d’expression est dérégulé dans d’autres pathologies neurodégénératives, telles que la démence fronto-temporale et la maladie de Parkinson. Il est donc possible que la famille miR-132/212 contribue au processus neurodégénératif de ces pathologies.
Dans ce contexte, les travaux présentés visent à étudier le rôle de la famille miR-132/212 dans la MA et, plus généralement, dans le cerveau.
Tout d’abord, puisque la famille miR-132/212 a déjà un rôle connu dans la formation des dégénérescences neurofibrillaires, nous avons évalué son implication dans la formation des plaques amyloïdes, deuxième caractéristique pathologique de la MA. Nous avons ainsi démontré que la délétion génétique de la famille miR-132/212 favorise la production du peptide Aβ et la formation de plaques amyloïdes chez le modèle murin 3xTg-AD. En utilisant une approche d’ARN-Seq et de bio-informatique, nous avons identifié des gènes faisant partie du réseau de la famille miR-132/212 qui ont des rôles dans la régulation du métabolisme de l'Aβ, y compris Tau, Mapk et Sirt1. En accord avec ces résultats, nous avons montré que la modulation du miR-132, ou de sa cible Sirt1,
démontré que les niveaux de la famille miR-132/212 corrèlent avec la quantité des plaques amyloïdes chez l'Homme.
Ensuite, afin d’élucider le rôle de la famille miR-132/212 dans le cerveau, nous nous sommes concentrés sur l’identification de cibles régulées par cette dernière. Dans un premier temps, cette analyse a été conduite dans plusieurs modèles cellulaires in vitro, dans lesquels le rôle du miR-132, un des deux composants de la famille, a été spécifiquement étudié. Dans ce contexte, nous avons démontré que les cibles régulées par le miR-132 sont peu nombreuses et spécifiques au type cellulaire considéré. Dans un deuxième temps, l’analyse d’identification des cibles a été conduite dans un modèle de souris de délétion conditionnelle pour la famille miR-132/212 que nous avons spécifiquement généré. Nous avons ainsi caractérisé des cibles et des réseaux moléculaires modulés par la famille miR-132/212 dans ce modèle.
Pris ensemble, ces résultats suggèrent que i) Le réseau de la famille miR-132/212, dont Sirt1 et probablement d'autres gènes cibles, participe à la production du peptide Aβ et la formation de plaques amyloïdes dans la MA ; ii) Même si le miR-132 peut potentiellement cibler un grand nombre de gènes simultanément, son ciblage est sélectif et spécifique au contexte cellulaire étudié. Enfin, les résultats obtenus mettent en évidence un ensemble de nouvelles cibles et de voies de signalisation régulées par la famille miR-132/212.
En conclusion, ces travaux contribuent à l'avancement des connaissances du rôle physiologique et pathologique de la famille miR-132/212 dans le cerveau.
ABSTRACT
Alzheimer's disease (AD) is the most common form of dementia in the world. At the microscopic level, two main pathological features characterize the brain of AD patients: amyloid plaques, consisting of aggregates of the Aβ (Amyloid Beta) peptide, and neurofibrillary tangles, formed by aggregates of abnormally hyperphosphorylated Tau protein. Endogenous factors that may be involved in the progression of AD include microRNAs (miRs). MiRs are small non-coding RNAs that regulate the expression of target genes at the post-transcriptional level. In particular, the miR-132/212 family is strongly downregulated in the brain of AD patients. Previous studies have shown that in the 3xTg-AD mouse model of AD, the genetic deletion of the miR-132/212 family leads to an increase in phosphorylation and aggregation of Tau protein, two mechanisms leading to the formation of neurofibrillary tangles.
Apart from its role in AD, the miR-132/212 family is also involved in several neurological disorders. In particular, its level of expression is deregulated in other neurodegenerative pathologies, such as frontotemporal dementia and Parkinson's disease. It is therefore possible that the miR-132/212 family contributes to the neurodegenerative process of these pathologies.
In this context, the work presented aims to study the role of the miR-132/212 family in AD and, more generally, in the brain.
First of all, since the miR-132/212 family already has a known role in the formation of neurofibrillary tangles, we wanted to evaluate its involvement in the formation of the other major pathological feature of AD: the amyloid plaques. We have demonstrated that the genetic deletion of the miR-132/212 family promotes Aβ production and amyloid plaque formation in the 3xTg-AD mice. Using RNA-Seq and bioinformatics, we identified genes of the miR-132/212 network with documented roles in the regulation of Aβ metabolism, including Tau, mapk, and sirt1. Consistent with these findings, we show that the modulation of miR-132, or its target sirt1, can directly regulate Aβ production in cells. Finally, we have shown that miR-132/212 levels correlate with the amount of amyloid plaques in humans.
Then, in order to elucidate the role of the miR-132/212 family in the brain, we focused on identifying targets regulated by the miR-132/212 family. In a first step, this analysis was conducted in several in vitro cell models, in which the role of miR-132, one of two components of the family, was specifically studied. In this context, we have demonstrated that the targets regulated by miR-132 are few and specific to the cell type considered. In a second step, the target identification analysis was conducted in a conditional knockout mouse model for the miR-132/212 family that we specifically generated. We have therefore characterized the molecular targets and networks modulated by the miR-132/212 family in this model.
Taken together, these results suggest that i) miR-132/212 network, including Sirt1 and likely other target genes, contributes to abnormal Aβ metabolism and senile plaque deposition in AD; ii) Although miR-132 can potentially target a large number of genes simultaneously, its targeting is selective and specific to the cellular context studied. Finally, the results obtained highlight a set of new targets and signalling pathways regulated by the miR-132/212 family.
In conclusion, this work contributes to the advancement of the knowledge of the physiological and pathological role of the miR-132/212 family in the brain.
TABLE DE MATIÈRE
RÉSUMÉ ... iii
ABSTRACT... v
TABLE DE MATIÈRE ... vii
LISTES DES TABLES ... x
LISTE DES FIGURES ... xi
LISTE DES ABRÉVIATIONS ... xiii
REMERCIEMENTS ... xvii
AVANT-PROPOS ... xix
CHAPITRE 1 : INTRODUCTION ... 1
1. La maladie d’Alzheimer ... 2
1.1. Mise en contexte ... 2
1.1.1. Historique de la maladie d’Alzheimer ... 2
1.1.2. Les chiffres ... 2
1.1.3. Les facteurs de risques et les deux formes de la maladie d’Alzheimer ... 3
1.2. La neuropathologie de la MA ... 3
1.2.1. Les plaques amyloïdes ... 5
1.2.2. Les dégénérescences neurofibrillaires ... 9
1.2.3. Les autres neuropathologies ... 13
1.3. Les symptômes et le diagnostic ... 14
1.4. Les traitements ... 16
1.4.1. Les traitements actuels ... 16
1.4.2. Les traitements futurs : les thérapies modificatrices de la maladie ... 17
2. Les microARNs... 18
2.1. La biogenèse ... 18
2.2. Les mécanismes d’action des miRs... 21
2.3. La prédiction bio-informatique des cibles moléculaires des miRs ... 22
2.3.1. Les caractéristiques des outils de prédiction des cibles moléculaires des microARNs ... 22
2.3.2. Les outils de prédiction des cibles ... 27
2.4. Stratégies expérimentales pour l’identification de cibles moléculaires de miRs... ... 28
2.4.1. Stratégies basées sur le profilage ... 30
2.4.2. Technologies basées sur la capture des complexes miRs-cibles ... 37
2.4.3. Analyse des processus biologiques régulés par les miRs ... 44
2.4.4. Analyse des interactions miR-ARNm fonctionnelles ... 45
2.5. Les fonctions des microARNs dans le cerveau ... 46
2.6. La famille du microARN-132/212 ... 48
2.6.1. La séquence et l’expression ... 48
2.6.2. La régulation ... 50
2.6.3. La fonction physiologique ... 51
Objectif 1 - Analyse du rôle de la famille miR-132/212 dans un modèle de
souris de la maladie d’Alzheimer ... 62
Objectif 2 - Identification et caractérisation des cibles de la famille miR-132/212 ... 63
Méthodes ... 63
CHAPITRE 2 : ANALYSE DU RÔLE DE LA FAMILLE MIR-132/212 DANS UN MODÈLE DE SOURIS DE LA MALADIE D’ALZHEIMER ... 66
microRNA-132/212 deficiency enhances Aβ production and senile plaque deposition in Alzheimer's disease triple transgenic mice ... 67
1. Résumé ... 68
2. Abstract ... 68
3. Introduction ... 69
4. Results ... 70
4.1. miR-132/212 deficiency in mice promotes Aβ pathology ... 71
4.2. Identification of miR-132 gene networks in vivo... 73
4.3. Regulation of Aβ production by miR-132 ... 76
4.4. Correlation between miR-132 and Aβ in humans ... 78
5. Discussion ... 80
6. Methods ... 83
6.1. Study approval ... 83
6.2. Post-mortem tissue ... 83
6.3. Mice ... 83
6.4. Cell culture and transfection ... 84
6.5. Western Blotting ... 84 6.6. ELISA ... 85 6.7. Immunohistochemistry ... 85 6.8. miRNA quantification ... 85 6.9. RNA sequencing ... 86 6.10. Antibodies ... 86 6.11. Acknowledgements ... 87 6.12. Supplementary ... 87
CHAPITRE 3 : IDENTIFICATION ET CARACTÉRISATION DES CIBLES DE LA FAMILLE MIR-132/212 ... 97
1. Partie 1 (in vitro) ... 98
1.2. Résultats ... 100
1.2.1. Comparaison des cibles du miR-132 dans les fibroblastes, les HEK293T et les kératinocytes ... 100
1.2.2. Comparaison des cibles du miR-132 dans les Neuro2a et les Ht22 ... 100
1.3. Conclusion... 101
2. Partie 2 (in vivo) ... 102
2.1. Résultats ... 104
2.1.1. Génération et validation du modèle de souris de délétion conditionnelle pour la famille miR-132/212 ... 104
2.1.2. Dissociation neuronale et tri des cellules TdTomato par cytométrie en flux………... ... 108
2.1.3. ARN-Seq et analyse d’enrichissement des cibles de la famille miR-132/212.. ... 109
2.2. Conclusion... 115
3. Matériels et Méthodes ... 115
3.1. Approbation de l'étude ... 115
3.2. Souris ... 115
3.3. Traitement au tamoxifène ... 116
3.4. Culture cellulaire et transfection ... 116
3.5. Dissociation neuronale ... 117 3.6. Analyse FACS ... 117 3.7. Quantification de miRs ... 118 3.8. Séquençage de l’ARN ... 118 3.9. Immunofluorescence ... 118 3.10. Analyse de Microarrays ... 119
3.11. Analyse d'enrichissement des cibles du miR-132 ... 119
3.12. Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ... 119
3.13. Analyses statistiques ... 119
CHAPITRE 4 : DISCUSSION ... 121
CONCLUSION GÉNÉRALE ET LIMITES DE L’ÉTUDE ... 130
PERSPECTIVES ... 131
BIBLIOGRAPHIE ... 133
ANNEXES ... 162
Annexe 1 : Analyse de l’expression génique différentielle des fibroblastes ... 162
Annexe 2 : Analyse de l’expression génique différentielle des HEK293T. ... 187
Annexe 3 : Analyse de l’expression génique différentielle des Keratinocytes ... 213
Annexe 4 : Liste des cibles du miR-132 prédites par TargetScan et PicTar. ... 295
Annexe 5 : Analyse d’enrichissement sur les fibroblastes, les HEK293T et les kératinocytes ... 302
Annexe 6 : Analyse de l’expression génique différentielle des Neuro2a ... 306
Annexe 7 : Analyse de l’expression génique différentielle des Ht22 ... 386
Annexe 8 : Analyse d’enrichissement sur les Neuro2a et les Ht22. ... 423
Annexe 9 : Analyse de l’expression génique différentielle des cellules Tdtomato . 428 Annexe 10 : Analyse de l’expression génique différentielle du cortex ... 430 Annexe 11 : Analyse d’enrichissement sur les cellules TdTomato et sur le cortex 433
LISTES DES TABLES
Non è stata trovata alcuna voce dell'indice delle figure.
Supplementary Table 1 ... 94
Supplementary Table 2 ... 95
Supplementary Table 3 ... 95
Supplementary Table 4 ... 95
LISTE DES FIGURES
Figure 1 : Représentation d'un cerveau de patient atteint de la MA par rapport
à un cerveau sain ... 4
Figure 2 : Schéma des neurones d'un cerveau de patient touché par la MA par rapport à des neurones d’un cerveau sain ... 5
Figure 3 : Processus de maturation de la protéine APP à la membrane. ... 6
Figure 4 : Évolution des dépôts de plaques Aβ dans un cerveau affecté par la MA. ... 9
Figure 5 : Domaines protéiques de Tau et épissage alternatif dans le système nerveux central humain ... 10
Figure 6 : Modifications post-traductionnelles de Tau ... 11
Figure 7 : Schéma de distribution des DNF dans le cerveau ... 13
Figure 8 : La biogenèse des miRs ... 20
Figure 9 : Schéma d'une interaction d’un miR avec son ARNm cible ... 23
Figure 10 : Sites canoniques des ARNm. ... 24
Figure 11 : Sites non canoniques des ARNm. ... 25
Figure 12 : Stratégies d'identification expérimentale des cibles des miRs basées sur le profilage. ... 37
Figure 13 : Stratégies d'identification de cibles de miR basées sur les protocoles CLIP... 44
Figure 14 : Schéma d’un essai luciférase. ... 46
Figure 15 : Séquences du miR-132 et du miR-212 ... 49
Figure 16 : ELISA of human Aβ40 and Aβ42 in hippocampal samples of 3xTg-ADWT and 3xTg-ADKO mice ; Immunohistochemical detection of Aβ plaques in the forebrains of 18 month 3xTg-ADWT and 3xTg-ADKO mice; Thioflavine-S-positive stainings of Aβ plaques in the forebrains of 18 month 3xTg-ADWT and 3xTg-ADKO mice ... 72
Figure 17 : Schematic overview of RNA-Seq experiments ; Venn diagram demonstrating changes of mRNA transcripts between 3xTg-AD and Neuro2a models ; Bioinformatics analysis of miR-132/212 targets in up- or down-regulated set of genes ; Heatmap analysis of validated miR-132/212 targets in 3xTg-AD and Neuro2a systems ; Western blot analysis of Sirt1, ERK1/2, and Tau in 3xTg-ADWT and 3xTg-ADKO mice ; Western blotting of Sirt1, ERK1/2, and Tau in native Neuro2a and HEK293 cells following miR-132 transfection ... 75
Figure 18: ELISA of human Aβ40 and Aβ42 in Neuro2a-APPSwe and
HEK293-APPSwe cells after miR-132 treatment ; Western blot analysis of Sirt1 in Neuro2a-APPSwe and HEK293-APPSwe cells following miR-132 transfection ; ELISA of human Aβ40 and Aβ42 in HEK293-APPSwe cells
Figure 19 : Correlation between miR-132 expression levels, insoluble Aβ42,
Aβ plaque load in the ROS cohort and Sirt1 protein levels ; Correlation between miR-212 expression levels, insoluble Aβ42, Aβ plaque load in the ROS cohort and Sirt1 protein levels ; Correlation between Sirt1 protein levels and insoluble Aβ42 levels in the ROS cohort ; Western blot analysis of Sirt1 in non-demented controls and AD patients in the Douglas Bell Canada brain bank cohort ; Correlation between Sirt1 protein levels and
miR-132 in the Douglas Bell Canada brain bank cohort ... 79
Figure 20 : Méthodologie utilisée pour la partie 1 (in vitro). ... 99
Figure 21 : Résultats partie 1 (in vitro).. ... 101
Figure 22 : Méthodologie utilisée pour la partie 2 (in vivo). ... 103
Figure 23 : Génération du modèle de souris KO conditionnel pour la famille miR-132/212. ... 105
Figure 24 : Validation du modèle de souris de délétion conditionnelle pour la famille miR-132/212. ... 107
Figure 25 : Tri des cellules TdTomato et quantification du 132 et du miR-212... 108
Figure 26 : Analyse d’enrichissement de cibles du miR-132/212. ... 110
Figure 27 : Schéma des réseaux modulés dans le cortex des souris TdTomato miR-132/212 KO par rapport aux souris TdTomato miR-132/212 WT .... 115
Supplementary Figure 1 ... 88 Supplementary Figure 2 ... 89 Supplementary Figure 3 ... 90 Supplementary Figure 4 ... 91 Supplementary Figure 5 ... 92 Supplementary Figure 6 ... 93
LISTE DES ABRÉVIATIONS
2D-DIGE 2-Dimensional Differential Gel Electrophoresis
4SU 4-thiouridine
6SG 6-thioguanosine
A Adénine
AChE Acetylcholinesterase
ADAM10 Disintegrin and Metalloproteinase Domain-containing protein 10 ADNc ADN complémentaire
ADRDA Alzheimer Disease and Related Disorders
AICD Amyloid Precursor Protein Intracellular Domain
APOE4 Apolipoprotein E4
APP Amyloid Precursor Protein
APPsß Amyloid Precursor Protein secreted ß
APPsα Amyloid Precursor Protein secreted α
ARHGAP32 Rho GTPase Activating Protein 32
ARNm ARN messager
Aβ Amyloïde bêta
BACE1/2 Beta-secretase 1/Beta-secretase 2
BDNF Brain-derived neurotrophic factor precursor
BSA Bovin Serum Albumin
BTG2 BTG Anti-Proliferation Factor 2
C Cytosine
CA1 Cornus Ammonis 1
CAMK2A Calcium/calmodulin-dependent protein Kinase II Alpha
CCR4-NON Carbon catabolite repressor 4-Negative on TATA complex
CDK5 Cyclin-Dependent Kinase-5
CDS Coding DNA Sequence
CHIP-HSP90 C terminus of heat shock protein 70-interacting protein-heat shock protein 90 CLASH Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids
CLIP Crosslinking Immunoprecipitation
CREB c-AMP Response Element-binding protein
CTBP2 C-Terminal-Binding Protein 2
DGCR8 Drosha-DiGeorge Syndrome Critical Region Gene 8
DMD Diseases Modifying Drugs
DNF Dégénérescence neurofibrillaire
EOAD Early Onset Alzheimer Disease EP300 E1A Binding Protein P300
FOXO3 Forkhead Box O3
FOXP2 Forkhead box Protein P2
FTD Démence fronto-temporale
G Guanine
GEO Gene Expression Omnibus
GFAP Glial fibrillary acidic protein
GSK 3α/β Glycogen Synthase Kinase
GTP Guanosine TriPhosphate
GW182 Glycine-tryptophan protein of 182 kDa
HITS-CLIP High-throughput sequencing of RNA isolated by crosslinking immunoprecipitation
iCLIP Individual nucleotide resolution crosslinking and immunoprecipitation
IP Immunoprécipitation
iPAR-CLIP In vivo PAR-CLIP
IRAK1 Interleukin 1 Receptor Associated Kinase 1
IRAK4 Interleukin 1 Receptor Associated Kinase 4
IRM Imagerie par résonance magnétique
ITPKB Inositol-Trisphosphate 3-Kinase B
KDM5A Lysine-specific histone demethylase 5A
KDM7A Lysine-specific histone demethylase 1A
KO Knockout
LCR Liquide céphalo-rachidien
LOAD Late Onset Alzheimer Disease
LTP Potentialisation à long terme
MA Maladie d’Alzheimer
MAP Microtubule Associated Protein
MAPK Mitogen-Activated Protein Kinase
MCI Mild Cognitive Impairment
MeCP2 Methyl-CpG Binding Protein 2
miR microARN
MMSE Mini Mental State Examination
MP Maladie de Parkinson
MTBD Domaine de liaison aux microtubules
NGS Next-Generation Sequencing
NINDS National Institute of Neurological Disorders and Stroke
NMDA N-Methyl-D-Aspartate receptor
NOS1 Nitric oxide synthase 1
NURR1 Nuclear Receptor Related 1 protein
P120RASGA
P P120 RAS GTPase Activating Protein P250GAP P250 GTPase Activating Protein
PAR-CLIP Photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation PiB-PET Pittsburgh compound B- Positron-emission tomography
PP2A Protein Phosphatase 2A
PRD Domaine riche en proline
PSEN1 Presenilin-1
PSEN2 Presenilin-2
PTEN Phosphatase And Tensin Homolog
PTGS Post transcriptional gene silencing
PVDF Polyfluorure de vinylidène
RASA1 RAS P21 Protein Activator 1
REST RE1 Silencing Transcription Factor
RIP RNA ImmunoPrecipitation
RISC RNA-induced silencing complex
ROS Reactive Oxigen Species
SEP Sclérose en plaques
SILAC Stable Isotope Labeling by Amino Acids in cell culture
SIRT1 Sirtuin-1
SNC Système nerveux central
ß-CTF ß-secretase C-Terminal Fragment
TAC Transcriptome Analysis Console
TEP Tomographie d’émission de positrons
TNF Facteur de nécrose tumorale
TRBP Trans activation response RNA binding protein
U Uracile
UTR Untranslated Region
WT Wildtype
REMERCIEMENTS
Je voudrais tout d’abord remercier mon directeur de recherche, le Dr Sébastien Hébert, de m’avoir accueillie dans son laboratoire, d'avoir toujours été disponible et de m’avoir constamment donné des conseils.
Je voudrais remercier les membres du jury d'avoir accepté et pris le temps d’évaluer ma thèse.
Je désire remercier toute l’équipe du Dr Hébert de m’avoir fait sentir à l’aise et appréciée dès le début de mon parcours de doctorat.
En particulier, je tiens à remercier Claudia pour son aide indispensable et pour son sourire, de m’avoir inspiré « la foi » à chaque expérience et de m’avoir rendue heureuse grâce à ses magnifiques chansons québécoises;
Pascal, pour m’avoir aidée pendant tout mon parcours, même après son « déménagement »;
Julia, alias petite Mexicaine, pour m’avoir appris beaucoup de choses, pour m’avoir écoutée et conseillée au besoin. Mon français ne serait pas si « parfait » sans ses corrections!;
Isabelle S., pour m’avoir toujours conseillée, pour avoir partagé une (petite) partie de ses connaissances avec moi et pour m’avoir envoyé ses « ondes positives » au besoin!; Andréanne, alias Antidote, pour sa disponibilité et pour ses consultations d’orthographe française!;
Emmanuelle, alias Sandwish, pour son sourire constant, pour ses blagues et ses conseils, pour avoir toujours trouvé le temps de demander « ça va ? » même dans ses moments difficiles, pour son réconfort et surtout d’avoir supporté mes exutoires;
Isabelle G., pour ses conseils et son énorme patience lors des longues attentes pour manger!;
Sepideh, pour ses conseils et ses histoires extravagantes.
Je désire également remercier toutes les personnes faisant partie des autres équipes qui ont rendu mon expérience de doctorat plaisant en créant un milieu de travail très amical : Mathilde, Nicolas, Melody, Maud et Giulia, toujours prêts à conseiller et à écouter
mes problèmes, Ophélie pour sa spontanéité et ses histoires amusantes, Marie-Kim pour son amour pour le « pomelo ».
Je voudrais également remercier Françoise et Nathalie d'avoir toujours été souriantes, disponibles et gentilles.
Je voudrais aussi remercier les personnes qui, à l’extérieur du laboratoire, m’ont aidée à connaître et à apprécier le Québec. Particulièrement, un gros merci à Quentin et à Denise, qui m’ont aidée à m’intégrer dans ce pays « étranger ».
Merci à ma famille.
Grazie alle Rainone Women, sempre presenti! Grazie per aver sopportato la mia lontananza, per essere state sempre dalla mia parte e per avermi protetto. Grazie alla mia mamma, che ha trovato nella differenza di fuso orario una bella scusa per giustificare la sua insonnia. Grazie per essere stata a telefono con me fino ad addormentarti (e a raccontarmi i tuoi sogni!). Grazie al mio papà e alla nonna, che hanno accettato di vedermi andare via per così tanto tempo.
Grazie ai miei amici di sempre, Margherita, Stefano, Rosaura et Giada, per non aver mai dimenticato di chiedermi “quando torni?”
Grazie ad Andrea, per il suo sostegno, la sua pazienza, il suo amore e le sue pizze buonissime.
AVANT-PROPOS
Les résultats présentés dans ce manuscrit sont issus de mes travaux de doctorat réalisés au cours des trois dernières années dans le laboratoire du Dr Sébastien Hébert.
Le manuscrit est divisé en quatre chapitres. Le chapitre 1 est une revue de la littérature qui permet d’introduire mon sujet de doctorat. Le chapitre 2 contient des résultats présentés sous forme d’article publié. Dans ce chapitre, la numérotation des figures de l’article a été changée pour une intégration adéquate dans le manuscrit. De plus, en raison des limitations d'espace, trois tableaux supplémentaires (tableaux supplémentaires 2-4) n’ont pas été inclus dans le chapitre. Ils peuvent être trouvés en ligne sur le lien suivant https://www.nature.com/articles/srep30953#supplementary-information. Le chapitre 3 contient des résultats préliminaires non publiés. Il inclut deux parties ; chaque partie présente une mise en contexte, des résultats et une conclusion. Ensuite, les matériels et méthodes, qui concernent les deux parties, sont présentés. Le
chapitre 4 contient une discussion de l’ensemble des résultats présentés et des
perspectives qui en découlent.
Le manuscrit contient également une section « annexes », qui représente une partie importante de ce manuscrit (environ 250 pages) et qui contient des listes des données générées par des expériences d’ARN-seq et de Microarrays.
CHAPITRE 2 : ANALYSE DU RÔLE DE LA FAMILLE MIR-132/212 DANS UN MODÈLE DE SOURIS DE LA MALADIE D’ALZHEIMER
Ce chapitre décrit mon étude sur le rôle de la famille miR-132/212 dans la maladie d’Alzheimer. Pour cela, la souris modèle de la maladie d’Alzheimer 3xTg-AD a été utilisée.
Cette étude a donné lieu à la publication de l’article suivant :
microRNA-132/212 deficiency enhances Aβ production and senile plaque deposition in Alzheimer's disease triple transgenic mice.
Julia Hernandez-Rappa, Sara Rainonea, Claudia Goupil, Véronique Dorval, Pascal Y.
a These authors contributed equally to this work.
L’élaboration du projet et l’écriture de l’article ont été effectuées par le Dr Hébert. Le Dr Planel, le Dr Calon et la Dre Cicchetti ont fourni des échantillons. La Dre Hernandez-Rapp, C. Goupil, la Dre Dorval, le Dr Smith, M. Saint-Pierre, M. Vallée et moi-même avons fait les expériences. La Dre Hernandez-Rapp, M. Vallée, le Dr Droit et moi-même avons analysé les données. Tous les auteurs ont révisé le manuscrit. Pour ma part, j’ai effectué la plupart des expériences en cellules (transfections, immunobuvardage), in vivo (immunobuvardage) et les analyses bioinformatiques.
Cet article a été publié en 2016 dans le journal Scientific Report.
CHAPITRE 3 : IDENTIFICATION ET CARACTÉRISATION DES CIBLES DE LA FAMILLE MIR-132/212
Ce chapitre décrit mon étude sur des cibles de la famille miR-132/212 in vitro et in vivo. Pour cela, plusieurs modèles cellulaires ont été utilisés ainsi qu’un modèle de souris avec une délétion conditionnelle pour la famille miR-132/212.
J’ai effectué la plupart des expériences ainsi que toutes les analyses et les figures présentées dans ce chapitre. En ce qui concerne les expériences, le tri des cellules TdTomato a été effectué par un spécialiste à la Plateforme de FACS du CHUL (Centre Hospitalier de l’Université Laval) ; le séquençage et le traitement des reads (jusqu’à leur alignement au génome) ont été effectués par un spécialiste à la Plateforme d’ARN-seq du CHUL ; la génération du modèle de souris a été planifiée par mon équipe et effectuée par le personnel de l’animalerie du CHUL. Enfin, Claudia Goupil a participé aux expériences de dissociation neuronale et au traitement de souris au tamoxifène.
1. La maladie d’Alzheimer
1.1. Mise en contexte
1.1.1.Historique de la maladie d’Alzheimer
Alois A. - « Quel est votre prénom? »Auguste D. - « Auguste » Alois A. - « Nom de famille? » Auguste D. - « Auguste »
Alois A. - « Quel est le prénom de votre mari? » Auguste D. - « Je crois Auguste »
Alois A. - « Votre mari? »
Auguste D. - « Ah, mon mari… » Alois A. - « Êtes-vous mariée? » Auguste D. - « Avec Auguste » Alois A. - « Madame D.? »
Auguste D. - « Oui, avec Madame D. »
Ceci n’est qu’un des nombreux dialogues entre Auguste D. et son neurologue et psychiatre, Alois Alzheimer, en 1907. À 51 ans, Auguste été admise à l'hôpital des malades mentaux et épileptiques de Francfort parce qu'elle présentait des signes cliniques tels que « une réduction de la compréhension et de la mémoire, ainsi que de l'aphasie, de la désorientation, un comportement imprévisible, de la paranoïa, des hallucinations auditives et des troubles psychosociaux prononcés (Maurer, Volk et al. 1997) ». Il s’agissait du premier cas décrit de la maladie d’Alzheimer (MA).
1.1.2.Les chiffres
La MA correspond à ~65% des cas de démence (Larson, Kukull et al. 1992). La démence est un syndrome caractérisé par un déclin fonctionnel et cognitif. La prévalence de la démence dont la cause est la MA augmente avec l'âge, de sorte qu'elle représente 5% de la démence dans le groupe d'âge entre 65-74 ans et 50% dans le groupe d'âge des plus de 85 ans (Desai and Grossberg 2005). La MA est responsable de la réduction de l'espérance de vie de 50% à partir du moment où le diagnostic est posé chez les patients de plus de 70 ans (Larson, Shadlen et al. 2004). Selon le rapport mondial annuel sur la
maladie d’Alzheimer1, basé sur l’analyse systématique des données de prévalence et
l'incidence des coûts de démence, 47 millions de personnes souffraient de démence en 2016. Ce chiffre devrait presque doubler tous les 20 ans, pour atteindre 74,7 millions de personnes démentes en 2030 et 131,5 millions en 2050. Au Canada, en 2016, 564,000 personnes étaient atteintes de démence. Chaque année, les Canadiens dépensent 10,4 milliards de dollars pour prendre soin des personnes atteintes par la démence (Alzheimer Society of 2016).
1.1.3.Les facteurs de risques et les deux formes de la maladie d’Alzheimer
Bien que la MA soit typiquement une maladie tardive associée au vieillissement, il existe des cas d'apparition précoce. Cela a permis de diviser la MA en deux types : « débutprécoce » ou EOAD (Early Onset Alzheimer Disease) et « début tardif » ou LOAD (Late
Onset Alzheimer Disease). Les sujets dont les symptômes apparaissent avant 65 ans entrent dans la catégorie EOAD et représentent environ 1% du total des cas (Rocca, Amaducci et al. 1986). Les deux types de MA ont une forte composante génétique. En particulier, en ce qui concerne le EOAD, le 1-5% de cas sont causés par la présence des mutations autosomiques dominantes sur les trois gènes APP (Amyloid Precursor Protein), PSEN1 (Presenilin-1) et PSEN2 (Presenilin-2) (Baillie, Barnett et al. 2011, Evrony, Cai et al. 2012, Hardy, Bogdanovic et al. 2014). La présence d’autres variantes génétiques, telles que l’allèle APOE4 (Apolipoprotein E4) (Liu, Liu et al. 2013), peut significativement augmenter le risque de développer le EOAD. En ce qui concerne les LOAD, bien que certains facteurs de risque génétiques aient été identifiés, la pathologie est surtout liée à une combinaison de facteurs incluant des facteurs de risque potentiellement modifiables basés sur le style de vie, tels que l'éducation, la situation socioéconomique, l'activité physique, le profil cardiovasculaire ou métabolique (Norton, Matthews et al. 2014, Katsnelson 2015). Enfin, le vieillissement reste le principal facteur de risque des formes LOAD de la MA (Tanzi 2012).
1.2. La neuropathologie de la MA
La MA est caractérisée, au niveau macroscopique, par une diminution du volume du cerveau, appelée atrophie cérébrale. Cette atrophie concerne surtout la région
hippocampique, l’amygdale temporale et l’extrémité antérieure du lobe temporal et elle est associée à une dilatation des ventricules (Figure 1). Les régions du cerveau affectées par cette perte contrôlent l'apprentissage, la mémoire, les réactions émotionnelles et le comportement (Nelson, Alafuzoff et al. 2012). Au niveau microscopique, la MA est caractérisée par deux types de lésions principales : les plaques amyloïdes
extracellulaires, constituées d'agrégats de protéines Aβ (Amyloïde Bêta), et les dégénérescences neurofibrillaires (DNF) intracellulaires ou enchevêtrements neurofibrillaires, formés par des agrégats intracellulaires de la protéine Tau (Figure 2).
Figure 1 : Représentation d'un cerveau de patient atteint de la MA (à droite) par rapport
à un cerveau sain (à gauche). L'atrophie conduit à une diminution de la surface cérébrale et à un élargissement des ventricules (espaces remplis de liquide céphalo-rachidien). Adapté de (https://www.alz.org).
Figure 2 : Schéma des neurones d'un cerveau de patient touché par la MA (à droite)
par rapport à des neurones d’un cerveau sain (à gauche). Le cerveau malade présente les plaques amyloïdes et les DNF. Adapté de (https://www.brightfocus.org).
1.2.1.Les plaques amyloïdes
Les plaques amyloïdes sont des dépôts extracellulaires du peptide Aβ. Le peptide Aβ est produit naturellement par le métabolisme de la protéine APP. L'APP est une glycoprotéine transmembranaire de type I composée d'un grand ectodomaine, un seul domaine transmembranaire et une courte terminaison cytoplasmique (Figure 3). La plupart des études sur APP ont été menées dans le cerveau (Puig and Combs 2013), où cette protéine et ses produits de clivage jouent un rôle important dans la fonction synaptique, la plasticité, la neurogénèse et la réponse au stress cellulaire (Wang, Das et al. 2011, Kogel, Deller et al. 2012). En particulier, la production d’Aβ est un processus physiologique favorisé par l'activité synaptique et la plasticité (Li, Uemura et al. 2013). L’Aβ contribue également à l'homéostasie des lipides en liant et en transportant le cholestérol (Umeda, Mori et al. 2010).
La maturation de la protéine APP peut suivre deux voies distinctes : une voie
non-amyloïdogénique, qui ne produit pas Aβ, et une voie non-amyloïdogénique, qui aboutit
Figure 3 : Processus de maturation de la protéine APP à la membrane. Dans la voie
non-amyloïdogénique (à gauche), l’APP est initialement clivée par l’α-sécrétase et ensuite par la γ-sécrétase, pour générer APPsα, AICD et P3. Dans la voie amyloïdogénique (à droite), l’APP est initialement clivée par la ß-sécrétase et ensuite par la γ-sécrétase, pour générer APPsβ, AICD et les différents peptides Aβ. Adapté de (Kumar, Kumar et al. 2017).
Dans la voie non-amyloïdogénique, stimulée surtout par l’activité synaptique (Hoey, Williams et al. 2009), l’APP est initialement clivée par l’α-sécrétase ADAM10 (Disintegrin and metalloproteinase domain-containing protein 10) (Prox, Bernreuther et al. 2013, Corbett, Gonzalez et al. 2015). Après ce clivage, le fragment α-CTF (α-secretase C-terminal fragment) reste inséré dans la membrane neuronale et le fragment APPsα (Amyloid precursor protein secreted α) est libéré dans le milieu extracellulaire. Le fragment α-CTF est ensuite reconnu par le complexe γ-sécrétase, qui effectue un clivage conduisant à la libération intracellulaire de l’AICD (amyloid precursor protein intracellular domain) et extracellulaire du fragment P3 (Takagi-Niidome, Sasaki et al. 2015). Dans cette voie non-amyloïdogénique, l’α-sécrétase clive dans la séquence d’Aß, ce qui empêche toute production de ce peptide.
Dans la voie amyloïdogénique, l'APP est clivée par les β-sécrétases BACE1 (Beta-secretase 1) (Vassar, Kuhn et al. 2014). Le fragment ß-CTF (β-(Beta-secretase C-terminal fragment) reste ancré à la membrane, tandis que le fragment soluble APPsβ (Amyloid precursor protein secreted ß) est libéré. Ensuite, le complexe γ-secrétase clive ß-CTF pour former AICD et différents fragments Aß. Les fragments Aß les plus produits sont Aß40 et Aß42 (Thinakaran and Koo 2008, Zhang, Thompson et al. 2011). L’Aß40 se trouve principalement dans le cerveau sain, il est soluble et moins neurotoxique qu’Aß42,
qui est hautement neurotoxique. Aß42, par contre, a tendance à s'agréger et se retrouve principalement dans le cerveau des patients atteints de la MA (Mucke and Selkoe 2012). L'équilibre entre la voie amyloïdogénique et non-amyloïdogénique est essentiel à la pathogenèse de la MA. La protéolyse par la voie amyloïdogénique est associée à l'accumulation du peptide Aβ qui devient donc neurotoxique (Walsh and Selkoe 2007), tandis que la voie non-amyloïdogénique empêche non seulement la production d’Aβ, mais génère également l’APPsα qui présente des propriétés neuroprotectrices (Mattson, Cheng et al. 1993, Ring, Weyer et al. 2007).
Les cerveaux de patients atteints par la MA présentent des niveaux élevés de BACE1 et de son activité (Fukumoto, Cheung et al. 2002, Holsinger, McLean et al. 2002, Cole and Vassar 2007), ce qui pourrait jouer un rôle dans le débalancement des deux voies de maturation de l’APP.
De la même manière, les deux gènes PSEN1 et PSEN2, impliqués dans la MA, codent pour des protéines qui composent le complexe de la y-sécrétase, soulignant l’importance de la maturation de l’APP dans la pathogenèse de cette maladie (Bekris, Galloway et al. 2011).
Notamment, la production du peptide Aß n’est pas le seul mécanisme à la base de l’accumulation et de la formation des plaques amyloïdes dans la MA. En effet, l’accumulation du peptide pourrait également provenir d’une altération, dans le cerveau des patients atteints par la MA, des mécanismes de clairance du peptide Aß (Wildsmith, Holley et al. 2013). Plusieurs mécanismes ont été proposés pour la dégradation d’Aß, y compris le transport, médié par des récepteurs, à travers la barrière hématoencéphalique (Shibata, Yamada et al. 2000, Vogelgesang, Cascorbi et al. 2002) et la dégradation, médiée par différentes enzymes, de ce peptide (Caccamo, Oddo et al. 2005). À ce jour, la contribution relative de la production et la clairance de l'Aß n'est pas bien comprise (Bateman 2005).
Dans toutes ses formes, le peptide Aß joue un rôle très important dans la progression de la MA. La forme monomérique d’Aß pourrait avoir un rôle protecteur, en inhibant ou modulant la formation des agrégats amyloïdes (Rajasekhar, Chakrabarti et al. 2015). Au sein des plaques amyloïdes, la forme la plus commune d’Aß est la forme fibrillaire. Quand
elle aurait un effet pathogène (Pepys 2001). Des études récentes suggèrent que les formes intermédiaires oligomériques, produites pendant la formation de fibrilles, pourraient être les véritables facteurs toxiques (Verma, Vats et al. 2015). En effet, ces oligomères pourraient déclencher un dysfonctionnement neuronal et des altérations d'apprentissage et de mémoire avant l'apparition des signes cliniques de la MA, conduisant à un déclin cognitif (Jeong 2017).
Les dépôts de plaques amyloïdes peuvent altérer la fonction neuronale de différentes façons. Une première altération de la fonction neuronale est représentée par un dérèglement de la LTP (potentialisation à long terme). La LTP est un mécanisme cellulaire sous-tendant l'apprentissage et la mémoire. Chez le rat, des études montrent que les oligomères Aß réduisent la LTP bien que les mécanismes sous-jacents ne soient pas entièrement compris (Walsh, Klyubin et al. 2002). Aβ intervient également dans la dysfonction mitochondriale (Grimm, Friedland et al. 2016). Par exemple, dans un modèle de souris triple transgénique de MA, appelé TauPS2APP, Aβ altère spécifiquement le complexe IV du système de phosphorylation oxydative (Rhein, Song et al. 2009). Enfin, la glie joue un rôle dans la toxicité d’Aß. Les plaques amyloïdes initient des réponses inflammatoires dans le cerveau, conduisant à l'activation des astrocytes et au recrutement de la microglie, des processus qui ont été largement décrits comme étant impliqués dans la MA (Weninger and Yankner 2001, Wyss-Coray and Rogers 2012, Heneka, Carson et al. 2015, Heppner, Ransohoff et al. 2015).
Dans un cerveau de patient affecté par la MA, le dépôt des plaques Aβ suit une évolution en cinq phases (Figure 4). Dans la première phase, les plaques Aβ se trouvent exclusivement dans le néocortex. La deuxième phase est caractérisée par l'implication de l’allocortex. Dans la troisième phase, le striatum, les noyaux cholinergiques du prosencéphale basal et les noyaux diencéphaliques présentent également des dépôts d’Aβ. Dans la quatrième phase, plusieurs noyaux du tronc cérébral sont de plus en plus enrichis par les dépôts d’Aβ. Enfin, la dernière phase est caractérisée par un dépôt d’Aβ dans le cervelet (Thal, Rub et al. 2002).
Figure 4 : Évolution des dépôts de plaques Aβ dans un cerveau affecté par la MA. Dans
la phase 1, les dépôts d’Aβ se trouvent exclusivement dans le néocortex (noir) ; la phase 2 est caractérisée par l'implication de l’allocortex (rouge); dans la phase 3, le striatum, les noyaux cholinergiques du prosencéphale basal et les noyaux diencéphaliques présentent également des dépôts d’Aβ (rouge); dans la phase 4, plusieurs noyaux du tronc cérébral sont de plus en plus atteints par ces dépôts; enfin, la phase 5 est caractérisée par l'apparition de dépôts d’Aβ dans le cervelet. Adapté de (Thal, Rub et al. 2002).
Différentes études ont établi que la quantité de plaques amyloïdes ne corrèle pas avec la sévérité ou la durée de la pathologie MA (Arriagada, Growdon et al. 1992, Hyman, Marzloff et al. 1993, Bierer, Hof et al. 1995, Gomez-Isla, Hollister et al. 1997, Giannakopoulos, Herrmann et al. 2003, Ingelsson, Fukumoto et al. 2004, Minati, Edginton et al. 2009). Cependant, des évidences récentes ont montré que, lorsque l’on considère les plaques formées dans le striatum à des stades plus avancés de la MA, le dépôt amyloïde peut être prédictif de la démence (Beach, Sue et al. 2012, Nelson, Alafuzoff et al. 2012).
1.2.2.Les dégénérescences neurofibrillaires
Les DNF sont formées par des agrégats intracellulaires de la protéine Tau. La protéine Tau appartient à la famille MAP (Microtubule Associated Protein), qui comprend également les protéines MAP2 et MAP4. Contrairement à MAP4, qui est exprimée dans de nombreux tissus, MAP2 et Tau sont principalement présentes dans les neurones. Dans le cerveau adulte, MAP2 est surtout localisée dans les corps cellulaires et les dendrites,
Chez l’humain, la protéine Tau est codée par un gène formé de 16 exons. L'épissage alternatif donne lieu à 6 isoformes cérébrales majeures, qui diffèrent par le nombre d'insertions des séquences d'acides aminés (0N, 1N et 2N) dans la moitié amino-terminale de la protéine, et la présence de trois ou quatre domaines de liaison aux microtubules (3R ou 4R) dans sa moitié carboxy-terminale (Figure 5) (Guo, Noble et al. 2017).
Figure 5 : Domaines protéiques de Tau et épissage alternatif dans le système nerveux
central humain. Six isoformes de Tau sont générées dans le SNC (système nerveux central) humain par épissage alternatif du gène codant pour la protéine Tau. Des séquences d'acides aminés distinctes codées par les exons 2 et 3 dans la région N-terminale de Tau sont soit exclues (0N), soit différentiellement incluses donnant lieu à des isoformes Tau 1N (exon 2) ou 2N (exons 2 et 3). La région centrale de la protéine Tau comprend le PRD (domaine riche en proline). Un épissage alternatif de l'exon 10 dans le MTBD (domaine de liaison aux microtubules) conduits aux isoformes Tau 3R ou 4R. La région C-terminale est commune aux six isoformes Tau du SNC humain. Adapté de (Guo, Noble et al. 2017).
En conditions physiologiques, Tau adopte une conformation à «trombone», qui présente des interactions entre la partie amino-terminale et la partie carboxy-terminale (Jeganathan, von Bergen et al. 2006), afin de se lier aux microtubules (Wang and Mandelkow 2016). Une augmentation de la phosphorylation de Tau réduit son affinité pour les microtubules et ces changements apportent à Tau les propriétés dynamiques essentielles à la plasticité neuronale, processus à la base de l’apprentissage (Samsonov, Yu et al. 2004).
Bien que la protéine Tau puisse subir plusieurs types de modifications post-traductionnelles (Figure 6), la modification la plus décrite dans la MA est la phosphorylation. En effet, étant donné le grand nombre de sites potentiels de phosphorylation sur Tau (Hanger, Anderton et al. 2009), il n'est pas surprenant que la phosphorylation ait un impact profond sur sa fonction physiologique. La phosphorylation de Tau est étroitement contrôlée par l'équilibre entre les protéines kinases et phosphatases (Hanger, Anderton et al. 2009). Parmi les kinases les plus connues il y a GSK-3β (Glycogen Synthase Kinase), Cdk5 (Cyclin-Dependent Kinase-5) et MAPKs/ERKs (Mitogen-Activated Protein Kinase/extracellular-signal-regulated kinase) (Guo, Noble et al. 2017). Parmi les phosphatases, la plus connue est PP2A (Protein Phosphatase 2A), qui représente plus de 70% de l'activité phosphatase dans le cerveau (Liu, Grundke-Iqbal et al. 2005).
En conditions pathologiques, Tau peut devenir toxique à la suite de son hyperphosphorylation. Dans cette situation, certains épitopes sont phosphorylés à un degré plus élevé que dans le cerveau sain et d'autres résidus sont phosphorylés de novo (Kopke, Tung et al. 1993). Cette hyperphosphorylation réduit son affinité pour les microtubules, entraînant une déstabilisation du cytosquelette.
Figure 6 : Modifications post-traductionnelles de Tau. Illustration des modifications
post-traductionnelles identifiées sur Tau. Les barres colorées indiquent les sites approximatifs de chaque modification (Guo, Noble et al. 2017).
formant des oligomères et des agrégats de Tau d'ordre supérieur (von Bergen, Friedhoff et al. 2000, Liu, Grundke-Iqbal et al. 2005).
Plusieurs études indiquent qu'une augmentation de la phosphorylation de Tau pourrait induire une neurodégénérescence par des mécanismes autres que la perte de la fonction de liaison aux microtubules ou le gain d'espèces de Tau oligomériques ou agrégées toxiques. Premièrement, une phosphorylation de Tau induit son déplacement des axones au compartiment somatodendritique, compromettant l'intégrité des microtubules axonales et induisant un dysfonctionnement synaptique (Hoover, Reed et al. 2010). Deuxièmement, la phosphorylation de Tau peut perturber sa voie de dégradation intracellulaire. Par exemple, la protéine Tau phosphorylée sur la serine 262 ou la serine 356 n'est pas reconnue par le complexe protéasomique CHIP-HSP90 (C terminus of heat shock protein 70-interacting protein-heat shock protein 90) et est ainsi protégée de sa dégradation par le protéasome (Dickey, Kamal et al. 2007). Troisièmement, la micro-injection de Tau dans les terminaisons synaptiques augmente le calcium et perturbe la transmission synaptique par un mécanisme impliquant l'activation des kinases (Moreno, Morfini et al. 2016). Enfin, la phosphorylation modifie l'association de Tau avec ses partenaires, tels que la membrane cytoplasmique et l'ADN, perturbant les fonctions de Tau dans une gamme de voies de signalisation (Hanger, Anderton et al. 2009).
Comme pour les plaques amyloïdes (Thal, Rub et al. 2002), les DNF présentent un schéma de distribution caractéristique dans lequel se distinguent six stades (Braak and Braak 1991, Braak, Alafuzoff et al. 2006) (Figure 7). Les stades I et II sont caractérisés par une affection principale de la région transentorhinale avec une légère implication de l'hippocampe, en particulier de la zone CA1 (Cornus Ammonis 1), et une absence de changements isocorticaux. Ils sont donc appelés les «stades transentorhinaux». La principale caractéristique des stades III et IV est l’affection de la couche entorhinale et transentorhinale. L’hippocampe est affecté de façon légère ou modérée et l’atteinte isocorticale est encore faible. Ces stades sont donc appelés «stades limbiques». La caractéristique évidente des stades V et VI est l’affection de l'isocortex. Les étapes V et VI sont donc dénommées « étapes isocorticales ».
Figure 7 : Schéma de distribution des DNF dans le cerveau. Il est possible de distinguer
six stades (I-VI). Les stades I-II montrent des altérations confinées à la région transentorhinale (transentorhinal I-II), les stades III-IV se caractérisent par l’atteinte sévère de la couche entorhinale et transentorhinale (limbique III-IV). Les stades V-VI sont caractérisés par une affection de l’isocortex (V-VI isocorticale). L'augmentation de la densité de l'ombrage indique une augmentation de la sévérité des changements des DNF (Braak and Braak 1991).
Plusieurs études clinicopathologiques ont établi que la quantité et la distribution des DNF sont corrélés avec la gravité et la durée de la démence dans la MA (Arriagada, Growdon et al. 1992, Bierer, Hof et al. 1995, Gomez-Isla, Hollister et al. 1997, Hardy and Selkoe 2002, Giannakopoulos, Herrmann et al. 2003, Ingelsson, Fukumoto et al. 2004).
1.2.3.Les autres neuropathologies
La MA est une maladie neurodégénérative multifactorielle avec plusieurs protéines cibles contribuant à son étiologie. Ainsi, les dépôts d’Aβ extracellulaires et les DNF intracellulaires ne sont pas les seules neuropathologies qui caractérisent la maladie d’Alzheimer. Parmi les autres neuropathologies, nous pouvons mentionner l'inflammation, le stress oxydatif, la dérégulation des concentrations du fer et d’autres ions (Carreiras, Mendes et al. 2013). En effet, dans un cerveau atteint par la MA des études ont montré une accumulation et une infiltration importantes des cellules immunitaires activées, suggérant une contribution de la neuroinflammation à la pathogenèse de cette maladie (Dickson, Lee et al. 1993, Letiembre, Liu et al. 2009). Il
et d’astrocytes autour des plaques amyloïdes (Itagaki, McGeer et al. 1989, Kraft, Hu et al. 2013). Ces agrégations ont été associées à une expression modulée de diverses cytokines inflammatoires, dont l'interleukine-1, le facteur de nécrose tumorale-α et le facteur de croissance transformant-β (van der Wal, Gomez-Pinilla et al. 1993, Griffin, Sheng et al. 1995, Tarkowski, Blennow et al. 1999, Wang, Tan et al. 2015, Stamouli and Politis 2016, Su, Bai et al. 2016). Cependant, le rôle du système immunitaire local dans un cerveau malade reste à déterminer, à savoir s’il est la cause ou la conséquence de la MA, et s’il provoque un effet positif ou négatif sur la progression de la maladie (Takeda, Sato et al. 2014). Dans un cerveau de patient atteint par la MA, de grandes quantités d'espèces réactives de l'oxygène ou ROS (Reactive Oxigen Species) sont aussi générées. Les ROS oxydent les protéines, les lipides et l'ADN dans les cellules entourant les plaques amyloïdes et dans les neurones contenant les DNF (Fica-Contreras, Shuster et al. 2017, Zhang and Butterfield 2017). Enfin, les ions métalliques du fer, du cuivre et du zinc ont longtemps été associés à l'agrégation des plaques Aβ dans la MA, une interaction qui a été suggérée pour promouvoir le stress oxydatif et le dysfonctionnement neuronal (Bush 2003).
1.3. Les symptômes et le diagnostic
Les symptômes les plus communs de la MA sont la perte de mémoire, les problèmes de langage, la désorientation dans le temps et l'espace, le changement d'humeur et de personnalité.
Généralement, ces symptômes, qui caractérisent la phase clinique de la MA, se manifestent seulement après une longue période préclinique qui peut durer jusqu'à 20 ans. Selon la théorie proposée par De Strooper et Karran, il existe trois phases qui se suivent à partir de la période préclinique jusqu'à l'apparition des symptômes : une phase biochimique, une phase cellulaire et une phase clinique (De Strooper and Karran 2016). Au cours de la phase présymptomatique initiale, l'accumulation d'altérations biochimiques (phase biochimique) perturbe progressivement l'homéostasie cellulaire (phase cellulaire), entraînant une toxicité tissulaire accrue, la mort neuronale et l’altération de la mémoire (phase clinique). En particulier, la phase cellulaire se caractérise par la perturbation de plusieurs composantes cérébrales (neuronale, gliale, vasculaire, immunitaire) et le dérèglement de nombreuses voies de signalisation (De Strooper and Karran 2016).
Les critères de diagnostic, qui se basent sur l’identification de la MA à partir de l’altération précoce et significative de la mémoire épisodique (phase clinique), ont été établis en 1984 par le NINDS (National Institute of Neurological Disorders and Stroke).
Ces critères, appelés « NINCDS-ADRDA » (National Institute of Neurological Disorders and Stroke–Alzheimer Disease and Related Disorders), ont été ensuite mis à jour en 2011 (McKhann, Knopman et al. 2011). Il est donc possible, grâce à l’utilisation de ces derniers, de diagnostiquer une MA « probable » ou « possible ».
Par ailleurs, ces critères incorporent l’utilisation des plusieurs biomarqueurs, tels que la neuroimagerie structurelle avec IRM (imagerie par résonance magnétique), la neuroimagerie moléculaire avec TEP (tomographie d’émission de positrons) et l'analyse du LCR (liquide céphalo-rachidien). L’IRM est capable de détecter les changements de taille des régions du cerveau, un indicateur diagnostique de la maladie (O'Brien 2007). La TEP, et en particulier sa variante « PiB-PET » (Pittsburgh compound B-Positron-emission tomography), a été développée pour visualiser les dépôts d’Aβ chez l’humain. Enfin, les analyses du LCR se focalisent sur la détection des peptides Aβ et de la protéine Tau (Marksteiner, Hinterhuber et al. 2007). Actuellement, les biomarqueurs les mieux établis de la MA sont la réduction des niveaux d’Aβ42 dans le LCR et l'imagerie TEP du dépôt d’Aβ. Ces altérations pourraient débuter deux décennies avant la manifestation des premiers symptômes cognitifs (Beason-Held, Goh et al. 2013) et donc précéder la neurodégénérescence (reflétée par des concentrations accrues du ratio Tau/Tau phosphorylée dans le LCR) et l’atrophie cérébrale (Lewczuk, Riederer et al. 2017). Enfin, la seule façon de confirmer le diagnostic clinique de la MA est l’analyse histologique du cerveau post-mortem (McKhann, Drachman et al. 1984).
Chez les personnes âgées, il existe un état appelé déficience cognitive légère ou MCI (Mild Cognitive Impairment). Le MCI est un état transitoire entre une cognition normale et un déclin cognitif pathologique, tel que la démence (Kaduszkiewicz, Eisele et al. 2014). Le MCI est caractérisé par une performance cognitive inférieure à celle attendue pour l'âge, mais au-dessus du niveau pathologique qui caractérise la démence. Winblad et ses collaborateurs ont classé les manifestations cliniques du MCI en sous-types selon les domaines cognitifs altérés, tels que la mémoire, l'orientation et les capacités intellectuelles (Winblad, Palmer et al. 2004). Dans le cas d’une mémoire altérée, une personne atteinte par le MCI pourrait être exposée à un risque accru de développer la
maladie d'Alzheimer2. En général, il est possible de vérifier si le MCI est associé à la MA
grâce à une évaluation clinique et cognitive, suivie par le déroulement des tests auxiliaires, tels que la neuroimagerie, des études de laboratoire et l’évaluation neuropsychologique (Albert 2010).
1.4. Les traitements
1.4.1.Les traitements actuels
Les soins médicaux actuels pour le traitement de la MA sont limités aux médicaments qui réduisent les symptômes de la démence mais n'arrêtent pas le processus de dégénérescence (Lannfelt, Relkin et al. 2014). Sur le marché, il existe deux types des médicaments.
Un premier type de médicament est basé sur l’inhibition de l’acétylcholinestérase, l’enzyme qui dégrade l'acétylcholine, dans le but d’augmenter l'activité cholinergique. En effet, il existe une hypothèse appelée « cholinergique primaire » selon laquelle les dysfonctionnements cognitifs de la MA peuvent être attribués à la réduction de la neurotransmission au niveau des synapses cholinergiques à la suite de la mort neuronale (Babic 1999, Wevers, Witter et al. 2000). En particulier, les inhibiteurs de l'acétylcholinestérase, tels que le donépézil, la rivastigmine et la galantamine (Bond, Rogers et al. 2012), inhibent la dégradation de l'acétylcholine dans l'espace synaptique, augmentant par ce mécanisme la disponibilité de l'acétylcholine dans l'espace intersynaptique (Casey, Antimisiaris et al. 2010).
Le deuxième type de médicament est basé sur le blocage du récepteur NMDA (N-methyl-D-aspartate receptor), dans le but de réduire l'hyperactivité du système glutamatergique. En effet, dans les stades avancés de la MA, la déficience du système cholinergique est associée à une suractivation du système glutamatergique (Butterfield and Pocernich 2003, Danysz and Parsons 2012). Cette suractivation entraîne simultanément des phénomènes neurodégénératifs et des déficits cognitifs dus à l'altération des processus moléculaires qui sous-tendent des fonctions telles que la mémoire à court et à long terme (Collingridge and Singer 1990). En particulier, la
libération excessive du glutamate des neurones interfère avec la fonction des récepteurs postsynaptiques NMDA, récepteurs ionotropiques du glutamate qui conduisent à une entrée excessive de calcium dans les neurones (Danysz and Parsons 2012). Cet excès de calcium dans les mitochondries et dans le cytosol déclenche une cascade d'évènements moléculaires induisant une mort cellulaire programmée (apoptose) des neurones du cortex cérébral et de l'hippocampe à la suite desquels des déficits cognitifs apparaissent (Hughes, Nikolic et al. 2016). L’antagoniste du NMDA, la mémantine, est approuvée pour le traitement de la MA (Salomone, Caraci et al. 2012).
1.4.2.Les traitements futurs : les thérapies modificatrices de la maladie
Plusieurs études sont en cours pour identifier de nouveaux médicaments «modificateurs de la maladie » ou DMD (Diseases Modifying Drugs), capables d'agir
sur les bases pathogéniques de la MA et bloquant la progression de la maladie. Aß et Tau sont des cibles primaires pour le développement de thérapies DMD (Cummings and Fox 2017). Ces thérapies sont basées sur la réduction de la production d’Aß et de Tau, en empêchant l'agrégation ou le mauvais repliement, en neutralisant ou en éliminant ses agrégats toxiques ou les formes mal repliées ou, enfin, en combinant les modalités susmentionnées. Parmi les DMD, l'une des approches les plus innovatrices est l'immunothérapie (Morgan 2011).
Dans ce contexte, l'élimination des plaques Aß peut être favorisée par différents mécanismes via le système immunitaire tels que: i) des anticorps dirigés contre Aß42 au sein de plaques (Pul, Dodel et al. 2011); ii) Recouvrement, de la part des anticorps, des plaques amyloïdes suivi par la phagocytose de ces dernières par la microglie (Bard, Cannon et al. 2000); iii) l'élimination d’Aß42 du SNC par des anticorps qui restent au niveau du plasma et lient le peptide (DeMattos, Bales et al. 2001). Enfin plusieurs vaccins anti-Tau ont été développés pour sensibiliser le système immunitaire de l'hôte contre la protéine Tau hyperphosphorylée impliquée dans la MA (Panza and Logroscino 2017). En ce qui concerne toutes ces thérapies basées sur la réduction de la production d’Aß et de Tau, il est important de dire que, jusqu’à présent, aucune d'entre elles n’a entraîné l'amélioration des fonctions cognitives chez les patients (Godyn, Jonczyk et al. 2016).
Enfin, puisque la MA est considérée comme une maladie multifactorielle caractérisée par un dérèglement de plusieurs voies de signalisation fonctionnant simultanément et de manière synergique (Simoni, Bartolini et al. 2017), une autre catégorie importante de médicaments est représentée par les « médicaments multi-cibles » (Hopkins 2008). Cette approche vise à modifier simultanément les activités de plusieurs cibles, en particulier celles associées à la progression de la maladie (Hughes, Nikolic et al. 2016).
2. Les microARNs
Les microARNs (miRs) sont des ARNs non codants, formés d’environ 23 nucléotides, qui régulent l’expression génique au niveau post-transcriptionnel (He and Hannon 2004, Baltimore, Boldin et al. 2008). Pour ce faire, les miRs interagissent avec leurs ARN messagers (ARNm) cibles pour induire la dégradation des ARNm ou la répression de leur traduction (Jonas and Izaurralde 2015). Les miRs ont été identifiés pour la première fois chez Caenorhabditis elegans, où ils modulent le développement (Lee, Feinbaum et al. 1993). Chez l'homme, plus de 2000 miRs ont été identifiés et les analyses de prédictions computationnelles montrent que ceux-ci régulent l'expression d'environ 60% de tous les gènes codant pour des protéines (Friedman, Farh et al. 2009). Un seul miR peut réguler plusieurs ARNm et un ARNm peut être régulé par plusieurs miRs (Baltimore, Boldin et al. 2008). Les miRs régulent la plupart des processus biologiques chez les animaux, les plantes et même certains virus (Tufekci, Meuwissen et al. 2014). Leurs fonctions s'étendent de la prolifération cellulaire et de la différenciation à la réponse aux stimuli environnementaux et aux maladies telles que le cancer et les maladies neurodégénératives (Hayes, Peruzzi et al. 2014, Quinlan, Kenny et al. 2017). Pour cette raison, l'identification de miRs et de leurs cibles est fondamentale pour comprendre leurs rôles dans les voies de signalisation qui caractérisent ces processus (Baltimore, Boldin et al. 2008).
2.1. La biogenèse
Dans le noyau, les miRs peuvent être produits à partir d'introns d'ARNm codants pour des protéines ou à partir de gènes indépendants (codant spécifiquement pour le miR) (Kim, Han et al. 2009, Krol, Loedige et al. 2010). Ces transcrits, appelés pri-miRs,
