Partie 1 (in vitro)

La partie 1 se divise en deux sous-parties. Ces dernières sont caractérisées par une analyse transcriptomique effectuée sur plusieurs types cellulaires. Chaque type cellulaire est traité soit avec un mimétique (pré-miRs) du miR-132, soit avec une séquence

contrôle « Scrambled » (séquence qui ne cible aucun ARNm).

En particulier, la première sous-partie de ce travail est concentrée sur l’analyse transcriptomique par Microarrays de trois types cellulaires humains dérivés de différents tissus, c’est-à-dire les fibroblastes (dérivés de la glande mammaire), les cellules HEK293T (dérivées du rein) et les kératinocytes (dérivés de l’épiderme) (Figure 20). Pour les trois types cellulaires, les données brutes d’expression génique, appelée données .CEL, étaient déjà disponibles sur la base de données du NCBI GEO (Gene Expression Omnibus) (Barrett, Wilhite et al. 2013). L’utilisation du logiciel TAC (Transcriptome Analysis Console, Thermo Fisher Scientific) a permis, en partant des données .CEL, l’analyse de l’expression génique différentielle entre les cellules traitées avec le mimétique du miR-132 et les cellules traitées avec la séquence Scrambled. Cette analyse a donc mené à l’identification de l’ensemble des gènes modulés (à la hausse et à la baisse) à la suite de la surexpression du miR-132 dans les différents types cellulaires. Ensuite, afin de vérifier la présence d’un enrichissement de cibles du miR- 132 dans l’ensemble des gènes modulés, l’outil ToppGene Suite (Chen, Bardes et al. 2009) a été utilisé. Cet outil, basé sur l’utilisation des outils de prédiction des cibles de miRs, permet d’identifier et visualiser les cibles potentielles d’un miR si l’enrichissement de ses cibles est présent dans l’ensemble des gènes modulés. Parmi les outils de prédiction des cibles de miRs, TargetScan et Pictar ont été choisis. Ces deux outils se basent sur la même caractéristique, c’est-à-dire la correspondance de la séquence seed. Pour cette raison, ils ne font pas la distinction entre les cibles potentielles du miR-132 et du miR-212. L’identification des cibles potentielles du miR-132 a ensuite permis de comparer ces dernières dans les trois types cellulaires.

La deuxième sous-partie de ce travail est plutôt concentrée sur l’analyse transcriptomique par ARN-Seq de deux types cellulaires murins qui dérivent du même tissu (tissu nerveux) : les cellules de neuroblastome Neuro2a et les cellules de l’hippocampe Ht22 (Figure 20). Ces deux types cellulaires ont été également traités avec le mimétique (prémiRs) du miR-132 ou la séquence contrôle Scrambled. En particulier, les données transcriptomiques sur les cellules Neuro2a avaient déjà été générées pour la publication de l’article présenté au chapitre 2 de ce manuscrit (qui correspond au premier objectif de mon travail). Dans ce chapitre, les données ont été à nouveau analysées, car des paramètres plus stricts ont été utilisés (valeur p <0,01 au lieu de valeur p <0,05). En revanche, les données transcriptomiques sur les cellules Ht22 ont été générées à partir d’expériences spécifiquement conduites pour la réalisation de ce deuxième objectif. Les données brutes d’ARN-seq ont été analysées à l’aide du logiciel Partek® Flow® (Partek Inc., St. Louis, MO, USA), qui a permis l’identification des gènes modulés (à la hausse et à la baisse) à la suite de la surexpression du miR-132 dans les deux types cellulaires. Les analyses en aval, déjà mentionnées dans la première sous- partie, ont été ensuite effectuées.

Figure 20 : Méthodologie utilisée pour la partie 1 (in vitro). En haut, schéma de l’analyse

transcriptomique par Microarrays des fibroblastes, des cellules HEK293T et des kératinocytes, ainsi que des analyses en aval. En bas, schéma de l’analyse transcriptomique par ARN-Seq des cellules Neuro2a et Ht22, ainsi que des analyses en aval. Scr : Scrambled.

1.2. Résultats

1.2.1.Comparaison des cibles du miR-132 dans les fibroblastes, les

HEK293T et les kératinocytes

L’analyse de Microarrays a montré, pour les fibroblastes, la régulation de 518 gènes à la baisse et de 397 gènes à la hausse (Annexe 1) ; pour les HEK293T, la régulation de 490 gènes à la baisse et de 524 gènes à la hausse (Annexe 2) ; pour les kératinocytes, la régulation de 1204 gènes à la baisse et de 2034 gènes à la hausse (Annexe 3). Les trois types cellulaires présentent un fort enrichissement pour les cibles prédites du miR- 132 dans la liste des gènes régulés à la baisse exclusivement (Figure 21a). Le calcul de cet enrichissement se base sur les outils de prédiction TargetScan et Pictar. La liste des cibles du miR-132 prédites par ces deux outils est montrée dans l’Annexe 4.

La comparaison des cibles prédites du miR-132 dans les trois types cellulaires montre un faible chevauchement de ces dernières (Figure 21b). En fait, de manière inattendue, seulement 6 cibles sont partagées par les trois types cellulaires. Les résultats de l’analyse d’enrichissement sont présentés en détail dans l’Annexe 5.

1.2.2.Comparaison des cibles du miR-132 dans les Neuro2a et les Ht22

Conformément aux résultats observés dans le chapitre 2, les cellules Neuro2a montrent un enrichissement des cibles du miR-132 dans la liste des gènes régulés à la baisse exclusivement (Hernandez-Rapp, Rainone et al. 2016). L'expérience menée sur le Ht22 montre des résultats similaires (Figure 21c).

Également dans ce cas, les cibles prédites du miR-132 semblent être très différentes entre les deux lignées cellulaires. En fait, seulement 21 cibles sont partagées par les deux types cellulaires (Figure 21d). Les résultats de l’analyse d’enrichissement sont présentés en détail dans l’Annexe 8.

Figure 21 : Résultats partie 1 (in vitro). (a) Analyse d’enrichissement de cibles du miR-

132 dans les gènes régulés à la hausse et dans les gènes régulés à la baisse pour les trois types cellulaires (fibroblastes, HEK293T et kératinocytes). (b) Comparaison entre les cibles prédites du miR-132 dans les trois lignées cellulaires. Seulement les gènes régulés à la baisse ont été pris en compte pour l'analyse. Entre parenthèses est indiqué le nombre de cibles du miR-132 présentes dans TargetScan et Pictar et la combinaison des deux (colonne « total »). (c) Analyse d’enrichissement des cibles du miR-132 dans les gènes régulés à la hausse et dans les gènes régulés à la baisse pour les deux types cellulaires (Neuro2a et Ht22). (d) Comparaison entre les cibles prédites du miR-132 dans les deux lignées cellulaires. Seulement les gènes régulés à la baisse ont été pris en compte pour l'analyse. Entre parenthèses, le nombre de cibles du miR-132 présentes dans TargetScan et Pictar et la combinaison des deux (colonne « total »). Dans (a) et

(c), la valeur P **≤ 0,001, P ****≤ 0,00001 (test exact de Fisher et correction de

Bonferroni). Fb : fibroblastes, Kc : kératinocytes.

1.3. Conclusion

Les résultats obtenus dans cette première partie démontrent que le miR-132 régule, au niveau de l’ARNm, un nombre limité de cibles. De façon importante, les cibles régulées dépendent fortement du contexte considéré (type cellulaire ou tissu utilisé pour les

2, dans laquelle nous avons décidé d’analyser in vivo les cibles de la famille miR-132/212 dans un type cellulaire spécifique : les neurones excitateurs du cerveau antérieur exprimant CamK2a. Pour ce faire, nous avons généré un nouveau modèle de souris de délétion conditionnelle pour la famille miR-132/212 qui permet d’éteindre l’expression de ces miRs exclusivement dans les neurones excitateurs et à un temps spécifique.