Effets de l'étirement axial sur des cardiomyocytes murins déficients en dystrophine : dérégulation calcique et canaux TRPs

Pour l'obtention du grade de

DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ DE POITIERS UFR des sciences fondamentales et appliquées

Laboratoire Signalisation et transports ioniques membranaires - STIM (Poitiers) (Diplôme National - Arrêté du 7 août 2006)

École doctorale : Biologie-santé - Bio-santé (Limoges)

Secteur de recherche : Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie

Présentée par :

Elizabeth Aguettaz

Effets de l'étirement axial sur des cardiomyocytes murins

déficients en dystrophine : dérégulation calcique et canaux TRPs

Directeur(s) de Thèse : Christian Cognard, Stéphane Sebille Soutenue le 29 juin 2015 devant le jury Jury :

Président Patrick Bois Professeur des Universités, Université de Poitiers Rapporteur Philippe Gailly Professeur, Université catholique de Louvain Rapporteur Romain Guinamard Professeur des Universités, Université de Caen Membre Christian Cognard Directeur de recherche CNRS, Université de Poitiers Membre Stéphane Sebille Maître de conférences, Université de Poitiers

Membre Jean-Pierre Pennec Maître de conférences, Université de Bretagne Occidentale Membre Aubin Penna Chargé de recherche CNRS, Université de Rennes

Pour citer cette thèse :

Elizabeth Aguettaz. Effets de l'étirement axial sur des cardiomyocytes murins déficients en dystrophine :

dérégulation calcique et canaux TRPs [En ligne]. Thèse Aspects moléculaire et cellulaire de la biologie. Poitiers :

Pour l’obtention du Grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE POITIERS

(Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées) (Diplôme National – Arrêté du 7 août 2006)

Ecole doctorale : BioSanté

Secteur de Recherche : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie

Présentée par :

Elizabeth AGUETTAZ

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Effets de l’étirement axial sur des cardiomyocytes murins

déficients en dystrophine :

dérégulation calcique et canaux TRPs

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Directeurs de thèse : Dr. Christian COGNARD et Dr. Stéphane SEBILLE **************************

Soutenue le 29 juin 2015 Devant la Commission d’Examen

Jury

P. GAILLY Professeur, Université catholique de Louvain, Belgique Rapporteur R. GUINAMARD Professeur, Université de Caen, France Rapporteur J.P. PENNEC MCU, Université de Bretagne Occidentale, France Examinateur A. PENNA CR CNRS, Université de Rennes, France Examinateur P. BOIS Professeur, Université de Poitiers, France Examinateur C. COGNARD DR CNRS, Université de Poitiers, France Examinateur S. SEBILLE MCU, Université de Poitiers, France Examinateur

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier le Professeur Frédéric Becq de m’avoir accueilli au sein du laboratoire de Signalisation et Transports Ioniques Membranaires (STIM).

Je tiens également à remercie l’Association Française contre les Myopathies qui a entièrement financé de projet.

Je remercie le Professeur Patrick Bois de m’avoir accueillie dans son équipe et d’avoir accepté d’être membre de mon jury. Merci pour toutes tes idées de manip’ mêmes si elles n’ont pas forcément abouties et merci pour tes conseils, tes encouragements et ton soutien.

Je remercie les membres du jury qui ont accepté d’évaluer ce manuscrit : le Professeur Philippe Gailly et le Professeur Romain Guinamard d’avoir accepté d’être les rapporteurs de ma thèse et je remercie également le Dr Jean-pierre Pennec et le Dr Aubin Penna, examinateurs de ce travail. Je vous remercie de m’avoir fait l’honneur de participer à mon jury de thèse.

Je remercie le Dr Christian Cognard et le Dr Stéphane Sebille pour avoir dirigé ce travail durant ces 3 années, pour vos conseils et votre confiance. Merci Christian pour votre expertise technique surtout en microscopie (la lampe de quenching fonctionne toujours bien !). Merci pour vos conseils scientifiques et votre attention pour les petits détails… Ce fut très utile et cela m’a appris à faire attention à tout (surtout dans les figures). Les pauses café furent toujours agréables, surtout avec votre humour décapant ! Stéphane, merci pour tous vos conseils et votre patience pour m’expliquer comme bien faire les choses. Merci pour votre optimisme sans faille, votre enthousiasme et vos encouragements !

Dr Aurélien Chatelier, je te remercie pour ton écoute et pour tes conseils avisés. Tu m’as toujours donné du temps pour m’aider à comprendre ou réfléchir avec moi sur des problèmes expérimentaux ou sur l’analyse des résultats.

Pr Jean-François Faivre, merci pour ton aide (particulièrement quand j’ai dû écrire le résumé de ma thèse en 1700 caractères espaces compris !). Ton expérience et ta réflexion scientifique m’ont beaucoup apporté dans mon travail. Cela m’a appris à me poser les bonnes questions et à toujours réfléchir sur ce qu’on fait, tu as toujours la fameuse question à laquelle on n’avait pas pensé ! Merci également pour ton agréable compagnie, tes conseils, tes encouragements et ton écoute attentive.

Dr Jocelyn Bescond, compatriote breton, merci pour ta gentillesse et tes conseils.

Christophe, je te remercie pour ton aide et ta formation sur l’immunofluorescence. Ton expérience a toujours été très utile. Merci de m’avoir écouté et pour tes conversations intéressantes particulièrement sur tes lectures quelques peu étranges parfois…

Claudine, je te remercie d’avoir collé toutes ces boites pour moi ! J’ai beaucoup apprécié nos conversations, surtout sur les chats ! Entre passionnées, on se comprend !

Amandine, je suis très contente de t’avoir rencontré. Tu es celle qui m’a accueilli le premier jour de ma thèse et je me rappelle qu’on s’est vite bien entendu ! Merci pour toute l’aide que tu m’as apportée dans mes expériences et de m’avoir soulagé d’un peu de travail en préparant les solutions. J’ai apprécié ces moments sur la parcelle à discuter, ruminer ou encore à rire ! Bon courage pour la fin de ta thèse et surtout prends soin de toi et de ta santé ! Tu verras avec le temps, on arrive à relativiser…

Dr Grégoire Carré ou Grégory Rond… On a partagé une salle de manip’, on a râlé mais au final on a bien ri ! Merci de m’avoir formé à la dissociation cellulaire, tes conseils et ton expérience m’ont beaucoup apporté ! Merci pour ta bonne humeur et tes grégoiries…

Oualid, merci pour ton sourire et bon courage pour ta thèse ! Tu tiens le bon bout…

Merci à toute l’équipe de Tours, Pr Véronique Maupoil, Dr Pierre Bredeloux, Dr Claire Malécot, Dr Ian Findley, Angèle et Côme que j’ai côtoyé pour la plupart pendant mon stage de M2. Ce fut un très bon moment et j’étais très contente de vous retrouver dans mon équipe pendant ma thèse. Et Côme, bon courage pour ta thèse et essaye de ne pas écrire un manuscrit de 500 pages…

Dr Clarisse Vandebrouck, je te remercie pour tous tes conseils et ton expérience surtout dans le domaine de la DMD. Merci encore de m’avoir aidé à faire des vacations (malgré les quelques problèmes qu’on a eu…).

Dr Caroline Norez et Dr Thierry Ferreira, merci pour votre bonne humeur et votre sourire rayonnant !

Dr Johanna Bertrand, les pauses café furent toujours agréables en ta compagnie et bon courage avec Christophe !

Dr Christophe Simar, ton arrivée a redonné un coup de fouet au laboratoire avec ta voie qui porte et ta franchise ! Bon courage pour la fin de ton projet !

Sandra, il y a tellement de choses à dire ! Je me souviens de la première fois que je t’ai vu, tu m’as dit « je veux une tablette de chocolat noir », ça m’a fait beaucoup rire ! Je te remercie pour ton aide et tes nombreuses compétences dans beaucoup de domaines ! Merci d’avoir mis beaucoup de vie dans le laboratoire et pendant les pauses déjeuners (c’est vrai que quand tu n’étais pas là, c’était bien calme…). Merci de nous avoir fait rire volontairement ou involontairement… (Les « yaouts »). Bon courage pour suite et vive le rhum et le chocolat !

Merci à Jenny et Mathilde pour leur gentillesse et qui ont su m‘aider quand j’en avais besoin.

Dr Bruno Constantin, je te remercie pour ton aide et tes conseils pour mener mon projet. Le congrès en Allemagne fut très agréable en ta compagnie et merci de m’avoir permis de voir la mer Baltique !

Dr Nadine Deliot, merci pour ton aide et tes conseils.

Dr Thomas Harnois, je te dis un grand MERCI ! Tu m’as vraiment beaucoup aidé, conseillé et fournis en produits pour le fameux Western blot ! Ton expérience a vraiment été précieuse et m’a permis, après quelques péripéties, à enfin sortir un blot correct ! Ce fut vraiment un plaisir de te côtoyer tout au long de ces trois années et d’avoir eu la chance de te voir (enfin) décrocher ton CDI !

Dr José Javier Lopez Barba ou tout simplement Javi. Merci de m’avoir fait partager ton expérience autant intellectuelle que pratique. Ta compagnie fut très agréable et merci de nous avoir fait goûter quelques spécialités espagnoles ! Merci d’avoir gardé mes chats et pour toutes nos soirées jeux ! Et merci de nous avoir amené à la Rochelle, il aura fallu attendre l’arrivée d’un espagnol pour que je me décide à aller visiter pour la première fois cette ville.

Merci à toute l’équipe d’ImageUP et en particulier au Dr Anne Cantereau pour son aide et son expertise technique en microscopie confocale qui m’ont permis d’obtenir de belles images. Merci également à Emile Berré pour sa gentillesse et de m’avoir montré comment fonctionnait la microscopie à balayage et électronique.

Laurence, merci de t’être aussi bien occupé de mes petites souris et de m’avoir toujours tenu informé de tout ce qui n’allait pas dans mon élevage ! Ta précieuse aide et ta compétence m’ont permis de ne pas m’inquiéter pour mon élevage !

Merci beaucoup à Christelle et Carole pour leur aide et leur efficacité dans leur travail ! Merci à James pour son aide et plus particulièrement sur le Biorad avec son système d’exploitation préhistorique ! Merci à Denis d’avoir fabriqué rapidement le support du laser et d’avoir percé mes nombreuses boites ! Et merci à Valérie Pinchault pour sa gentillesse et son écoute.

Merci au Dr Jean Marc Muller de m’avoir donné des heures de vacations malgré les petits problèmes avec l’administration…

Merci à Amandine Chépied pour avoir géré d’une main de maitre l’organisation du journal club et bon courage pour la fin de ta thèse qui approche à grands pas… et essaye d’éviter le Chili à l’avenir…

Merci à tous les autres doctorants que je n’ai pas cités, je vous souhaite à tous bon courage pour votre thèse et tenez bon !

Merci à ma petite Laurie pour toutes ses soirées/journées jeux et merci de continuer à me soutenir même si tu es un peu plus loin maintenant…

Je voudrais tout particulièrement remercier Mik pour sa patience et son soutien inébranlable pendant toutes ces années. Sans toi, ces années auraient été plus difficiles alors, Merci !

Merci à tous mes amis bretons qui m’ont changé les idées pendant les vacances ! ça fait toujours du bien de vous voir !

Enfin, je voudrais remercier ma famille et plus particulièrement ma mère et mon frère qui m’ont soutenu et encouragé depuis le début.

1

Sommaire

Abréviations ... 9

Etat de l’art ...14

I. La dystrophie musculaire de Duchenne ...14

A. Historique ...15

B. Origine ...17

C. La dystrophine ...18

D. Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine ...20

a) Composition ...20

b) Rôle du complexe associé à la dystrophine ...23

E. Les modèles d’étude de la DMD ...25

a) La souris mdx ...25

b) La dystrophie musculaire canine ...27

c) La dystrophie musculaire féline ...27

d) Les lignées cellulaires ...28

F. Physiopathologie ...29

a) Généralités ...29

b) Les quatre grandes hypothèses de la nécrose musculaire squelettique ...30

i. L’hypothèse mécanique ... 30

ii. L’hypothèse calcique ... 30

iii. L’hypothèse vasculaire ... 31

iv. L’hypothèse inflammatoire et du stress oxydatif ... 32

G. Les thérapies ...33

a) La thérapie par médication ...33

i. Les corticostéroïdes ... 33

ii. Les co-traitements stéroïdes/nutriments ... 33

b) La thérapie génique ...35

i. Les virus adéno-associés (AAV) ... 35

ii. Le saut d’exon ... 36

iii. La translecture ... 38

c) La thérapie cellulaire ...38

i. Les cellules satellites ... 39

ii. Autres cellules souches/progéniteurs du muscle squelettique ... 40

iii. Les progéniteurs myogéniques d’autres sources (non-conventionnelles) ... 40

II. La cardiomyopathie dilatée ...42

A. Généralités ...42

B. Les manifestations cliniques chez le patient DMD ...43

a) L’ECG : ...43

b) L’échographie : ...45

C. La cardiomyopathie dilatée chez la souris mdx ...46

a) Phénotype ...46

b) Les cardiomyocytes mdx ...46

D. Mécanismes cellulaires de la dystrophie musculaire ...48

a) Les voies d’influx calciques ...48

i. Les microruptures membranaires ... 48

ii. Les canaux activés par l’étirement (Stretch-activated channels – SACs) ... 50

iii. L’influx sodique et l’échangeur NCX ... 50

b) La dérégulation du réticular sarcoplasmique (RS) ...51

i. La fuite du RS ... 51

ii. La pompe SERCA ... 53

iii. Les modifications post-traductionnelles des RyRs ... 53

L’oxydation des RyRs ... 53

1. La nitrosylation des RyRs ... 54

2. La phosphorylation des RyRs ... 54 3.

3

III. Les canaux mécanosensibles (MSCs) ...57

A. Généralités ...57

a) La relation de Frank-Starling ...57

b) Le réflexe de Bainbridge ...58

B. La mécanotransduction ...59

a) Par la bicouche lipidique ...59

b) Par le cytosquelette ...59

c) Les canaux mécanosensibles (Mechanosensitive channels : MSCs) ...60

C. Les canaux activés par l’étirement ou ‘stretch-activated ion channels’ (SACs) ...62

a) Selectivité ionique ...62

b) Dépendance au voltage ...63

c) Dépendance à l’étirement ...63

d) Effet de l’étirement sur les concentrations ioniques internes ...64

i. La concentration intracellulaire de calcium ([Ca2+]i )au repos ... 64

ii. Modulation des variations calciques par l’étirement ... 64

L’entrée de calcium par les courants calciques de type L ... 65

1. L’entrée de calcium par les SACs ... 65

2. Les entrées de calcium par l’échangeur Na+-Ca2+ (NCX) ... 66

3. E. Les candidats moléculaires des SACs ...68

a) Les candidats moléculaires SACk ...68

i. TREK-1 ... 68

ii. Les canaux BKCa ... 69

iii. Les canaux KATP ... 70

b) Les SACs cationiques non sélectifs (SACns) ...70

i. Les canaux TRPs ... 71

Généralités sur les TRPs ... 71

1. Activation des TRPs : ... 72

2. Structure des TRPs : ... 72

3. Propriétés fonctionnelles des TRPs ... 73 4.

La sous-famille des TRPCs ... 73 5. a) TRPC1 ... 74 b) TRPC6 ... 76 a) TRPC3 ... 78 La sous-famille des TRPVs ... 78 6. TRPV2... 78 Les autres TRPs ... 81 7. ii. Les piezo-protéines ... 81

F. La modulation pharmacologique des SACs ...84

a) Le gadolinium ...84

b) Les antibiotiques aminoglycosidiques...84

c) Le GsMTx-4 ...85

d) Les autres modulateurs ...86

Position du problème ...89

Matériels & méthodes ...92

I. Isolement des cardiomyocytes ventriculaires ...92

A. Matériel biologique ...92

B. Prélèvement ...92

C. Dissociation cellulaire ...92

a) Digestion enzymatique selon la technique de Langendorff ...92

b) Dissociation mécanique ...93

c) Ensemencement des cellules ...94

II. Le système d’étirement...95

A. Principe...95

B. Fabrication des supports de maintien des fibres de carbone...95

a) Fabrication de la tige de support des fibres de carbone ...95

b) Manipulation des cardiomyocytes avec les fibres de carbone ...97

c) Mesure de la longueur des sarcomères ...97

5

A. La microscopie de conductance ionique à balayage (ou SICM : Scanning Ion

Conductance Microscopy) ...99

a) Généralités ...99

b) Principe général ...99

B. Etude de la topographie membranaire ... 102

a) Dispositif expérimental ... 102

b) Paramètres d’acquisition ... 104

c) Protocole ... 104

d) Analyse des images ... 104

i. Le rapport surface réelle sur surface projetée (SR/SP) ... 105

ii. Mesure de l’intervalle entre les motifs de régularité ... 105

iii. Tests statistiques ... 105

IV. Etudes des microruptures membranaires ... 106

A. La microscopie confocale ... 106

a) Principe général : ... 106

b) Principe de fluorescence : ... 107

c) Les différents types de microscopes confocaux ... 107

i. Microscope confocal Olympus FV1000 ... 107

ii. Microscope confocal Bio-Rad MRC1024 ... 108

d) Les sondes FM4-64 et FM1-43 ... 108

B. Etude des microruptures ... 109

a) Etudes des microruptures suite à un choc osmotique ... 109

b) Etude des microruptures suite à un étirement axial ... 109

c) Analyses des images ... 109

V. Etude de l’activité calcique ... 111

A. Mesure des variations de la concentration intracellulaire de calcium ... 111

a) La sonde Fluo-8, AM ... 111

a) Préparation des échantillons pour l’imagerie calcique ... 112

c) Analyses ... 113

B. Mesure des entrées cationiques par extinction de fluorescence du fura-2 par les ions Mn2+ ... 114

a) La sonde fura-2-AM ... 114

b) Microscope Olympus IX70 : ... 114

c) Principe ... 115

d) Préparation des échantillons ... 115

e) Protocole ... 115

f) Analyses ... 116

C. Molécules utilisées modifiant l’activité calcique ... 117

VI. Immunomarquage fluorescent ... 118

A. Principe... 118

B. Préparation des échantillons ... 118

VII. Biologie moléculaire : le western blot ... 119

A. Principe... 119

B. Extraction protéique ... 119

C. Dosage protéique ... 119

D. SDS-PAGE ... 120

E. Western-blot ou électrotransfert des protéines sur membrane ... 121

F. Détection immunologique des protéines ... 121

Résultats - Discussion ... 123

I. Etude de la topographie membranaire lors d’un stress mécanique ... 124

A. Préambule ... 124

a) Résultats précédents : Altérations ultrastructurales et fonctionnelles dans les cardiomyocytes mdx au repos ... 124

B. Etude de la topographie membranaire durant un étirement axial ... 127

a) Mesure de la longueur sarcomérique ... 127

b) Evaluation de la topographie membranaire lors d’un étirement axial ... 127

C. Les microruptures ... 132

7

b) Etude des microruptures membranaires ... 133

II. Régulation calcique au repos et pendant un étirement axial : implication des canaux TRPs ? ... 136

A. Résultats précédents obtenus au laboratoire ... 136

B. Mise en place d’un protocole d’activation des SACs ... 138

C. Caractérisation de l’entrée de Ca2+ dépendante des stocks dans les cardiomyocytes mdx au repos ... 140

a) Activation constitutive des canaux SOCs dans les cardiomyocytes mdx ... 141

b) L’expression de TRPC4 est augmentée dans le tissu cardiaque des souris mdx. 142 c) Les canaux TRPV2 : activation constitutive ? ... 143

d) L’entrée cationique constitutive implique les canaux TRPV2 et TRPCs ... 145

e) L’entrée cationique constitutive dans les cardiomyocytes mdx dépend des voies PKC et PI3K ... 146

f) Rôle de la voie PKC dans les influx cationiques dans les cardiomyocytes WT ? .. 147

g) Conclusion - Discussion ... 148

D. Axial stretch-dependent calcium increases in dystrophic cardiomyopathy: involvement of several TRPs channels ... 150

a) Contexte de l’étude ... 150

b) L’étirement axial des cardiomyocytes induit des influx cationiques ainsi qu’une augmentation de [Ca2+]i ... 150

c) Implication des SACs dans les influx cationiques et dans l’augmentation de [Ca2+]i induits par l’étirement ... 150

d) Implication des canaux TRPV2 dans les influx cationiques et dans l’augmentation de [Ca2+]i provoqués par l’étirement ... 151

e) Inhibition et activation par des modulateurs des canaux TRPs ... 151

f) Conclusion ... 152

E. Reproduction de l’article ... 153

F. Etude complémentaire : effet du poloxamer 188 sur les réponses calciques à l’étirement ... 181

Conclusion générale et perspectives ... 183

Annexe 2 Composition des milieux utilisés lors du marquage de cellules ou des coupes de cœur entier ... 190 Annexe 3 Composition des solutions utilisées pour le SDS-PAGE et le Western-blot ... 191

9

Abréviations

A

A

A

A

AB-extra TRPV2: Antibody extracellular TRPV2, Anticorps extracellulaire de TRPV2

ARN: Acide RiboNucléique

ARNm: Acide RiboNucléique Messager

ATP: Adénosine-5’TriphosPhate

B

B

B

B

BAPTA: (1,2-Bis(o-AminoPhenoxy)ethane-N,N,N',N'-TetraAcetic acid)

BIM: BisIndolylMaleïmide

BSA: Bovine Serum Albumin, Albumine de serum bovin

C

C

C

C

CAD: Complexe Associé à la Dystrophine

CamKII: Kinase II dépendante de la calmoduline

CICR: Calcium Induce Calcium Release, Libération calcique secondaire induite par le calcium

CK: Créatine Kinase

CMD: CardioMyopathie Dilatée

D

D

D

D

DMD: Dystrophie Musculaire de Duchenne

DMEM: Dulbecco’s Modified eEagle Medium Milieu d’Eagle modifié par Dulbecco

E

E

E

E

ECG: ElectroCardioGramme

EGTA: Ethylene Glycol TetraAcetic acid

FFFF

G

G

G

G

GPCR: G Protein Coupled Receptor – Protéine G couplée à un récepteur

GRMD: Golden Retriever Muscular Dystrophy

GsMTx-4: Peptide du venin de tarentule Grammostola rosea

H

H

H

H

IIII

11 IP3R: Récepteur à l’Inositol Trisphosphate

K

K

K

K

KB: KraftBrühe Bouillon de culture de base

kDa: kilodalton

M

M

M

M

mdx: Muscular Dystrophy, X-linked, modèle murin de la DMD

MEC: Matrice ExtraCellulaire

MSC : MechanoSensitive Channels –Canaux mécanosensibles

N

N

N

N

NCX: Echangeur Sodium-Calcium

NO: Monoxyde d’azote

NOS: NO Synthase

O

O

O

O

OAT: Organic Anion Transporteur – Transporteur d’anions organiques

PPPP

PBS: Phosphate Buffer Saline

PI3K: Phosphoinositide 3-kinase

PKA: Protein Kinase A PKC: Protein Kinase C PLN: PhosphoLambaN Prb: Probénécide

R

R

R

R

ROS: Dérivés réactifs de l’oxygène Reactive Oxygen Species

RS: Réticulum Sarcoplasmique

RyR: Canaux-récepteur à la ryanodine Ryanodine Receptor

S

S

S

S

SAC: Stretch-Activated Channel, canal activé par l’étirement

SERCA: Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase

SIC: Stretch-Inactivated Channel, canal inactivé par l’étirement

SICM: Scanning Ion Conductance Microscopy – microscopie de conductance ionique à balayage

SOC: Store-Operated Channels – Canaux dépendant des stocks

SOCE: Store-Operated Calcium Entry – entrée de calcium dépendante des stocks

STIM: Stromal Interaction Molécule – molécule d’intéraction stromale

Strp: Streptomycine

T

T

T

T

13 TRP: Transient Receptor Potential

TRPC: Transient Receptor Potential Canonical

TRPV: Transient Receptor Potential Vanilloid

Tubules T: Tubules Transverses

U

U

U

U

W

W

W

W

Y

Y

Y

Y

Etat de l’art

I.

La dystrophie musculaire de Duchenne

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est une maladie neuromusculaire entrainant une dégénérescence musculaire progressive. Son incidence est d’une naissance sur 3500 garçons (Emery, 1999; Drousiotou et al, 1998 ; Bradley et Parsons, 1998).

La plupart des patients sont diagnostiqués vers l’âge de 5 ans lorsque leur capacité physique diffère de manière caractéristique d’avec les autres enfants du même âge. La force musculaire se détériore et l’utilisation de fauteuil roulant se révèle nécessaire avant l’âge de 10 ans. A l’adolescence, des complications respiratoires, orthopédiques et cardiaques émergent et, sans intervention, la survie des patients ne dépasse pas 19 ans.

L’observation d’un déficit moteur associé à une hypertrophie musculaire permet le diagnostic de la DMD. De plus, l’augmentation de la concentration en créatine kinase, enzyme du muscle libérée dans le sang en cas de lésions musculaires est également un élément de diagnostic de cette pathologie. Enfin, la réalisation d’une biopsie musculaire permet de confirmer la dystrophie musculaire de Duchenne.

Actuellement, aucun traitement curatif de la DMD n’existe. Cependant, un diagnostic précoce et une prise en charge multidisciplinaire, rapide et régulière (orthopédique, respiratoire, cardiaque…) permet le ralentissement de cette pathologie. Grâce à la mise en place de ces différentes thérapies, la qualité de vie de l’enfant peut être ainsi améliorée et la progression de la pathologie ralentie.

15

A.

Historique

Les premières observations de la DMD datent de 1851 par Edward Meryon, médecin britannique (1809-1880). Dans une conférence de la « Royal Medical and Chirurgical Society » en décembre 1851, il présenta le cas de huit patients appartenant à trois familles de la même fratrie (Emery et Emery, 1993). Ses descriptions cliniques furent détaillées et les symptômes similaires à ceux de la DMD. En effet, les patients montraient des difficultés pour marcher et pour monter les escaliers dès le plus jeune âge puis une perte de la faculté ambulatoire et le décès survenant à l’adolescence. Des études plus poussées post-mortem sur les patients permirent à Edward Meryon de remarquer que la pathologie était liée aux muscles et non à la moelle épinière et d’attribuer le nom de « dégénération granulaire des muscles volontaires » à la maladie. En 1853, William John Little (1810-1894) publia un livre sur ses observations du développement de la pathologie chez deux frères de 12 et 14 ans dont il avait étudié l’évolution dès leur plus jeune âge. L’autopsie de ces patients lui permit d’observer que le tissu musculaire était largement remplacé par de la graisse. En 1861, Guillaume Benjamin Amand Duchenne (-sur-Mer où il est né) (ou Duchenne de Boulogne, 1806-1875) a caractérisé de manière plus précise la dystrophie musculaire de Duchenne. En effet, il attribua la cause de cette pathologie à un désordre cérébral qu’il appella “ paraplégie hypertrophique de l’enfance ”. En 1868, après avoir confirmé que ce trouble était relié aux muscles, il proposa des critères de diagnostic basés sur des observations anatomiques ainsi que des stimulations électriques. Des biopsies musculaires lui permirent d’observer que le tissu musculaire était remplacé par du tissu fibreux ou conjonctif. De plus, il observa que l’état des patients, pendant les stades précoces de la maladie, pouvaient être amélioré par l’hydrothérapie et des massages accompagnés de stimulations électriques. L’ensemble des travaux de Duchenne lui ont valu l’attribution de son nom à cette pathologie.

En 1886, les recherches de William Richard Gowers, médecin neurologue et pédiatre britannique (1845-1915) ont permis de montrer que les cas isolés de dystrophie étaient plus rares que ceux détectés dans la même famille avec des antécédents du côté maternel. Il décrivit ainsi qu’une femme pouvait avoir des enfants développant la DMD même si les pères étaient différents. De plus, il caractérisa la manière de se lever de ces enfants. En effet, la manœuvre (dont le nom lui a été attribué) pour se mettre debout en partant d’une position couchée est présentée dans la figure 1 (Gowers, 1886).

Enfin, le neurologue allemand, Wilhelm Heinrich Erb (1840-1921) fut le premier à tenter de classifier les différentes dystrophies observées (Engel et al, 1994).

Figure 1 : Dessins de Gowers d’un enfant atteint de dystrophie musculaire se levant du sol. (D’après Engel et al, 1994)

17

B.

Origine

Les défauts génétiques responsables de la DMD ont été identifiés (Monaco et al, 1985) et localisés sur le locus Xp21 du chromosome X humain. Le gène cloné a été utilisé pour identifier le produit de ce gène, une protéine, la dystrophine. Des études ont montré que cette protéine était absente ou très diminuée (quantité inférieure à 3 %) chez les patients DMD (Hoffman et al, 1987). Le gène de la dystrophine qui constitue 1 % du chromosome X est parmi les plus grands gènes connus avec ses 2,6 millions de paires de bases. Sa partie codante d’environ 14 kilobases possède 79 exons séparés par des introns pouvant atteindre 200 kilobases (Koenig et al, 1987). Ainsi, la dystrophine est seulement codée par 0,6 % du gène. En raison de la taille importante de ce gène, l’occurrence des mutations éventuelles peut être augmentée. Ces mutations peuvent être de différents types : délétion d’exons (responsables de 65 % des myopathies de Duchenne), duplication ou mutation ponctuelle. Ces évènements conduisent d’une manière générale à un décalage du cadre de lecture pouvant engendrer l’apparition d’un codon stop prématuré. La protéine ainsi produite sera tronquée, entrainant le développement d’une dystrophie.

C.

La dystrophine

La dystrophine est une protéine d’environ 427 kDa composée de 3685 acides aminés qui appartient à la famille des protéines β-spectrine/α-actinine. Cette protéine a été identifiée dans les muscles, le cortex, la rétine et les cellules de Purkinje (Ahn et al, 1993). A l’origine, les myoblastes n’expriment pas la dystrophine, mais lorsque qu’ils se différencient, ils fusionnent et la dystrophine est alors détectable dans les myotubes (Lev et al, 1987; Nudel et al, 1988; Klamut et al, 1989; Barnea et al, 1990).

Dans les fibres musculaires squelettiques, elle est localisée au niveau de la face cytoplasmique du sarcolemme (Watkins et al, 1988) avec une expression importante au niveau des jonctions neuromusculaires et myotendineuses (Arahata et al, 1988). Dans les cellules cardiaques, la dystrophine se situe le long des tubules T (Kostin et al, 1998). Cette protéine représente 5 % des protéines du sarcolemme et 0,002 % des protéines des muscles striés (Hoffman et al, 1987) (figure 2).

Figure 2 : Localisation cellulaire de la dystrophine.

(A) Coupe immunohistochimique transversale d’un muscle squelettique sain montrant une localisation membranaire de la dystrophine (Blacke et al, 2002). (B) Immunomarquage de la dystrophine d’un cardiomyocyte ventriculaire sain (D’après Lorin et al, 2013).

La séquence de la dystrophine est relativement bien conservée entre les espèces (humains, rongeurs et poulets), notamment la partie 3’ non transcrite du gène, suivant le codon stop (Lemaire et al, 1988). L’analyse de la séquence des acides aminés permet de supposer que cette protéine est de forme allongée et qu’elle entre dans la composition du cytosquelette (Koenig et al, 1987).

L'analyse de la structure primaire de la dystrophine permet de distinguer quatre domaines structuraux distincts (figure 3):

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1- Le domaine N-terminal (les 240 premiers acides aminés) où une homologie de séquence au domaine de liaison de l’α-actinine est retrouvée (Hammonds, 1987). Ce domaine est un site de liaison au cytosquelette via les filaments d’(F)-actine (Levine et al, 1990; Hemmings et al, 1992; Way et al, 1992).

2- le grand « rod », domaine central de type triple hélice « spectrin-like » (aa 253-3040) qui est composé de 24 unités répétées semblables à celles retrouvées dans la β-spectrine.

3- Le troisième domaine est constitué de 280 acides aminés possédant 15 cystéines et une série de 142 acides aminés. Cette partie a une homologie de 24 % avec l’extrémité carboxy-terminale de l’α-actinine (Koenig et al, 1987).

4- La partie carboxy-terminale se compose d’environ 420 acides aminés. La section riche en cystéines (troisième domaine) et l’extrémité proximale sont indispensables pour la liaison de la dystrophine à son complexe associé (Bies et al, 1992; Matsumura et al, 1992 ; Ervasti et al, 1993; Jung et al, 1995). Ce domaine possède également une homologie significative avec l’utrophine, protéine encodée sur le chromosome 6 et appartenant à la même famille que la dystrophine (Love et al, 1989; Love et al, 1993).

Figure 3 : Gène (A) et structure secondaire (B) de la dystrophine.

(A) Organisation génomique du gène de la dystrophine, localisé sur le locus Xp21. Les lignes noires verticales représentent les 19 exons du gène constitué de 2.5 millions de bases. Les flèches indiquent les différents promoteurs spécifiques de certains tissus (B : Brain - cerveau, M : muscle, P : Purkinje) et R, B3, S et G représentent les promoteurs des formes Dp260 (Rétinienne), Dp140 (Brain3 – cerveau 3), Dp116 (cellules de Schwann) et Dp71 (Générale). (B) Composition des domaines de différentes formes de dystrophine. Le domaine amino-terminal (en vert) est suivi par le domaine spectrine-like (en bleu), le domaine riche en cystéines (en rouge) et le domaine carboxy-terminal (en gris) (D’après Muntoni et al, 2003).

D.

Complexe glycoprotéique associé à la dystrophine

a) Composition

Au niveau du sarcolemme, la dystrophine fait partie d'une structure macromoléculaire d’association de protéines appelée "complexe associé à la dystrophine" (CAD) ou

"Dystrophin-Associated Protein" (DAP). Ce complexe macromoléculaire est constitué de

protéines extracellulaires, transmembranaires et cytoplasmiques et pourrait donc assurer un lien mécanique fort et médier les intéractions entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire. Pour suivre la description qui suit, on se réfèrera à la figure 4. La dystrophine est liée au cytosquelette intracellulaire via son extrémité N-terminale qui est associée aux filaments d'actine tandis que son extrémité C-terminale interagit avec les membres du CAD, notamment le β-dystroglycan. Du côté extracellulaire de la membrane, l'α-dystroglycan lié au β-dystroglycan sert de récepteur pour la matrice extracellulaire.

À ce jour, dix-huit protéines ont été dénombrées dans le CAD: la laminine-α2 (mérosine), les dystroglycans (α et β), les sarcoglycans (α, β, δ, ε, γ), le sarcospan, la cavéoline-3, la Grb2, les syntrophines (α1, β1 et β2), la “ nitric oxyde synthase ” (NOS), l’α-dystrobrevine, la MAST205 (“ microtubule associated serine/threonine kinase 205 kDa ”) et la syncoiline. Cette étroite liaison entre la dystrophine et son complexe permet de connecter les myofibrilles au sarcolemme et à la matrice extracellulaire. Dans le cas de la DMD, en l’absence de dystrophine, les protéines du CAD ne se localisent plus au sarcolemme. Cette observation est également retrouvée chez les souris mdx, le modèle animal murin de la DMD (Ervasti et al, 1990; Ohlendieck et al, 1991). De surcroit, des myopathies peuvent également être développées lorsque les gènes codant pour certaines protéines du CAD sont altérés.

La laminine-α2, localisée entre le sarcolemme et la matrice extracellulaire représente le lien entre l’α-dystroglycan de la membrane plasmique et la lamina basale. Elle est formée de 3 hétérodimères : les chaînes α, β et γ (Leivo et al, 1988; Ehrig et al, 1990) et posséderait un rôle dans l’organisation d’une membrane basale structurée. Elle pourrait également servir de lien avec la membrane basale des cellules avoisinantes via les récepteurs localisés sur la surface cellulaire. La déficience de cette protéine peut entrainer une dystrophie musculaire congénitale.

Les dystroglycans sont des membres importants du DAP. En effet, leur déficience entraine la mort dès le stade embryonnaire chez les souris (Williamson et al, 1997). Le dystroglycan est clivé après la traduction en deux protéines : l’α-dystroglycan de 156 kDa et le β-dystroglycan de 43 kDa (Ervasti et al, 1990). La première est localisée sur la face externe du sarcolemme et assure la liaison avec la laminine. La seconde traverse la membrane et se lie à la

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dystrophine (Suzuki et al, 1994; Smalheiser et al, 1995). Le préfixe « dystro » provient de l’interaction directe entre la dystrophine et ces protéines et le terme « glycan » est issu de leur nature hautement glycosylée (Ibraghimov-Beskrovnaya et al, 1992). Il a été montré qu’une dystrophie des ceintures (pathologie affectant uniquement les muscles des épaules et des hanches) pouvait être induite par certaines mutations du gène de ces protéines (Salih et al, 1996). De plus, Chamberlain et al (1997) ont montré que des souris mutantes de la dystrophine qui ont perdu la capacité de se lier au β-dystroglycan entrainent également la diminution des sarcoglycans suggérant ainsi que le complexe des sarcoglycans est assemblé et ancré dans le CAD par le β-dystroglycan. Le complexe des sarcoglycans est formé de 5 sous-unités : α (50 kDa), β (43 kDa), δ (35 kDa), ε (50 kDa) et γ (35 kDa). Ce complexe est uni aux dystroglycans par association latérale. Cependant, à ce jour les domaines de liaisons exacts sont encore inconnus (Suzuki et al, 1994; Ozawa et al, 1995). La déficience d’une de ces sous-unités peut entrainer différentes dystrophies. Par exemple, une dystrophie musculaire autosomale récessive de l’enfance (dont les symptômes sont similaires à ceux de la DMD (Ben Hamida et al, 1983)) ou la dystrophie des ceintures de type 2D est induite par l’absence de l’α-sarcoglycan (Matsumura et al, 1992). Les autres sarcoglycans sont également associés à certains types de dystrophie des ceintures : type 2E (β-sarcoglycan), type 2C (γ-sarcoglycan) et le type 2F (δ sarcoglycan) (Straub et al, 1997; Ozawa et al, 1998).

A la surface des cellules musculaires, chaque membre du complexe des sarcoglycans forme une unité fonctionelle par une association étroite avec le sarcospan. Cette dernière est une protéine de 25 kDa qui possède quatre domaines transmembranaires et qui contient une large partie extracellulaire (Crosbie et al, 1997).

Le β-dystroglycan se lie également, par sa partie C-terminale, avec la cavéoline-3 et avec une protéine adaptatrice, la Grb2. La cavéoline-3 est une isoforme spécifique du muscle et est le composant structurel principal des cavéoles du sarcolemme. Cette protéine est également présente dans les tubules T pendant le développement musculaire. Dans le contexte de la DMD, il a été montré que l’expression de la cavéoline-3 était augmentée. Cependant, sa fonction au sein du CAD n’a pas encore été élucidée (Galbiati et al, 2000) bien que des études suggèrent que cette protéine inhiberait l’activité enzymatique de la NO synthase neuronale (Venema et al, 1997), intéragirait avec différentes molécules de signalisation (Song et al, 1996) et serait également impliquée dans la régulation du métabolisme énergétique (Scherer et Lisanti, 1997).

La Grb2 est une protéine constituée de domaines SH2 et SH3 (« Src homology domains »), permettant l’intéraction avec des protéines importantes dans la transduction de signaux intracellulaires (Schlaepfer et al, 1994). Au niveau du CAD, la Grb2 relie les domaines riches en proline de la β-dystroglycan par ses domaines SH3 (Yang et al, 1994).

Les syntrophines, l’α-dystrobrevine, la MAST et la NO synthase de type neuronal (nNOS) sont localisées sous le sarcolemme. Toutes les syntrophines (α, β1 et β2) possèdent un même poids moléculaire de 58 kDa, mais ont des points isoélectriques différents ce qui permet de les séparer sur un gel d’électrophorèse en deux dimensions (Yamamoto et al, 1993; Ahn et al, 1996). Des études in vitro ont permis de mettre en évidence la liaison des trois formes des syntrophines avec la dystrophine et ces protéines pourraient également s’associer avec des kinases, des canaux ioniques et plusieurs protéines de signalisation telle que la Grb2 (Oak et al, 2001). De surcroit, en l’absence de dystrophine, leur expression est réduite (Peters et al, 1994;Tachi et al, 1997). En microscopie électronique avec marquage à l’or colloïdal, l’α-syntrophine apparaît co-localisée avec la nNOS, ce qui démontre une possible interaction entre ces deux protéines (Wakayama et al, 1997). La NOS de type neuronale est exprimée dans plusieurs types cellulaires dont les cellules épithéliales, les cellules de la macula densa, les neurones et les muscles squelettiques (Grozdanovic et al, 1999). Cette enzyme est plus fortement concentrée dans la membrane des fibres de type II et son produit, l’oxyde nitrique (NO) est un messager qui module la force contractile (Kobzik et al, 1994). Lorsque la dystrophine est déficiente, la nNOS se délocalise dans le cytoplasme et continue de produire de l’oxyde nitrique. Cette situation anormale pourrait participer à la pathologie chez les patients DMD.

L’α-dystrobrevine est une protéine homologue à la dystrophine et qui est fortement concentrée au niveau du sarcolemme, des jonctions neuromusculaires et myotendineuses (Davies et Nowak, 2006). Cette protéine co-précipite avec le récepteur de l’acétylcholine et avec le CAD (Blake et al, 1996; Sadoulet-Puccio et al, 1997). Des structures hélicoïdales répétées permettent de connecter cette protéine à la dystrophine (Suzuki et al, 1995). De plus, des sites de liaison aux syntrophines ont également été identifiés (Peters et al, 1997). Des études ont montré que la dystrobrevine est fortement diminuée chez les patients DMD ainsi que dans certaines dystrophies des ceintures reliées aux sarcoglycans (Metzinger et al, 1997; Puca et al, 1998).

En 1999, le groupe de Chamberlain (Lumeng et al, 1999) a associé la MAST205 au complexe de la dystrophine. Ces travaux montrent que la MAST205 permet de relier le CAD aux microtubules par des domaines d’interaction PDZ entre la MAST205 et les syntrophines.

23

Figure 4 : Schéma du complexe glycoprotéique associé à la dystrophine. (D’après Fairclough et al, 2013). En 2001, Newey et al ont identifié l’interaction entre l’α-dystrobrevine et la syncoline. Cette dernière est fortement localisée au niveau de la membrane plasmique, des stries Z et dans les jonctions neuromusculaires des muscles squelettiques, cardiaques et lisses. Son interaction avec la desmine suggère un lien entre le complexe associé à la dystrophine et le réseau de filaments intermédiaires (Poon et al, 2002).

b) Rôle du complexe associé à la dystrophine

Le complexe associé à la dystrophine semble jouer plusieurs rôles dans la DMD ainsi que dans d’autres myopathies. Même si un grand nombre de ses composants a été identifié, il est actuellement impossible de déterminer un rôle précis pour chacun d’entre eux. Néanmoins, la découverte de ses composants permet de percevoir de nouvelles théories attenantes au rôle « mécano-signalétique » que pourrait jouer le CAD dans le muscle.

Avant la découverte de la dystrophine, des études ont montré une augmentation de la nécrose des fibres musculaires chez les patients DMD (Rowland, 1980). Cette nécrose a été attribuée à une insuffisance du maintien de l’intégrité de la membrane des fibres. Lors de la découverte de la dystrophine et de son association avec le sarcolemme, la notion de protection de la fibre musculaire vis-à-vis des dommages engendrés par des cycles répétés de contraction et de relaxation s’est alors accentuée. Le mécanisme pathologique a été décrit de la façon suivante : la fragilité membranaire affecte la perméabilité de la membrane des fibres, ce qui entraine une entrée importante d’ions calciques issus du milieu

extracellulaire. Cette entrée massive induit une diminution de la synthèse d’ATP par les mitochondries (Wrogemann et al, 1976), une activation des protéases neutres qui sont susceptibles de digérer les protéines des myofibrilles et du cytosquelette (Kar et Pearson, 1978), une augmentation de la dégradation des protéines médiée par la prostaglandine E2 (Rodemann et al, 1982) et une activation des phospholipases qui provoque une dissolution des phospholipides membranaires (Wong et Cheung, 1979; Farber, 1982; Jackson et al, 1984; Jackson et al, 1985). Tous ces phénomènes peuvent ainsi accentuer la fragilité de la membrane plasmique et générer une cascade d’événements permettant une entrée encore plus importante de molécules provenant du milieu extracellulaire. De plus, d’autres observations appuient l’hypothèse de la fragilité membranaire. En effet, l’examen des fibres musculaires anormales en microscopie électronique montre des brèches au niveau de la membrane de fibres non-nécrotiques ne présentant aucune autre anormalité structurale, ce qui représente un signe précoce d’une rupture des fibres musculaires (Mokri et al, 1975). De surcroit, un relargage anormal de créatine kinase et de myoglobine du sarcoplasme au sérum est observé lorsque le patient est au repos. Ce relargage est rapidement augmenté lorsque le patient réalise un exercice modéré (Florence et al, 1985). Des études ont montré que les muscles les plus atteints sont ceux qui doivent déplacer les charges les plus lourdes. Ainsi, les muscles demandant peu de force tels que ceux qui assurent le mouvement des yeux, sont épargnés parce qu'ils ne subissent que de faibles sollicitations mécaniques (Kaminski et al, 1992). De plus, les fibres musculaires à contraction rapide (de type II), qui sont sujettes à de grandes sollicitations mécaniques, sont sélectivement vulnérables chez les patients DMD.

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E.

Les modèles d’étude de la DMD

Les modèles disponibles sont d’une part des modèles animaux et d’autre part des modèles cellulaires en lignées. Trois modèles animaux présentent une déficience spontanée de la dystrophine dans les cellules musculaires : la souris mdx (X-Linked Muscular Dystrophy), la dystrophie musculaire canine dont le chien GRMD (Golden Retriever Muscular Dystrophy) et féline (chat HFMD pour Hypertrophic Feline Muscular Dystrophy). Il existe également des lignées cellulaires dépourvues de dystrophine. De plus, récemment, Larcher et al (2014) ont développé, dans leur laboratoire, un modèle de rats déficients en dystrophine en introduisant une délétion dans l’exon 23 du gène.

a) La souris mdx

Figure 5 : Photographie d’une souris mdx, modèle murin de la DMD.

Bulfield et al (1984) ont décrit pour la première fois la souris mdx dans une colonie de souris C57/BL/10Scn/Scn. Le défaut génétique est une mutation (transversion d’un nucléotide C pour un T) introduisant un codon stop prématuré dans un exon dans le gène codant pour la dystrophine (Sicinski et al, 1989). Ceci résulte en une dystrophine tronquée, ne possédant plus la capacité de se lier au sarcolemme dans les muscles des souris mdx. Quelques études ont montré que la progression de la maladie chez ce type de souris se réalisait en plusieurs étapes :

Dans la période postnatale immédiate, les muscles apparaissent histologiquement normaux mais une phase aigüe de nécrose musculaire apparait à l’âge de trois à quatre semaines et ceci est suivi par une stabilité apparente de la myopathie avec augmentation de l’âge (Cullen et Jaros, 1988). La récupération du muscle squelettique apparait juste après cette période de nécrose. Cette récupération peut être expliquée, en partie, par l’occurrence de la régénération musculaire importante de souris âgées de 30-40 jours, âge auquel le « turn-over » protéique est élevé (MacLennan et Edwards, 1990). Les muscles de souris mdx

âgées de 15 semaines s’atrophient progressivement et la fibrose devient évidente (Pastoret et Sebille, 1993).

Le remplacement des cellules musculaires squelettiques par du tissu conjonctif est limité. Néanmoins, le diaphragme de la souris mdx est plus proche du phénotype pathologique des patients DMD. Ces animaux développent également une cardiomyopathie dilatée (CMD). La fonction systolique du ventricule gauche reste normale jusqu’à l’âge de huit semaines puis progressivement la CMD s’installe pour être totalement établie à l’âge de 42 semaines (Quinlan et al, 2004). La paroi postérieure du ventricule gauche s’amincit, engendrant une dilatation de la chambre cardiaque, puis une fibrose apparaît qui se traduit par une augmentation d’un facteur 10 du tissu conjonctif (Spurney et al, 2008) (figure 6).

Figure 6 : Marquage au trichrome de Masson du tissu musculaire et de tissu fibreux

Exemples de marquage au trichrome de Masson du tissu musculaire (rouge) et du tissu fibreux (bleu) sur des coupes transversales de cœurs de souris saines (A) et mdx (B) âgées de 12 mois, observés au macroscope. Le cœur WT est constitué de 6 % de tissu fibreux alors que le cœur mdx en contient 20 %. Le pourcentage de tissu fibreux a été calculé en faisant le ratio tissu coloré en bleu sur la surface tissulaire totale. VG : ventricule gauche, VD : ventricule droit. (D’après Lorin et al, 2013)

Néanmoins, cette souris présente un phénotype moins sévère que les patients DMD. En effet, Lynch et al (2001) ont démontré que les faiblesses musculaires n’étaient pas une caractéristique évidente, que la durée de vie semble peu réduite et que ces animaux peuvent se reproduire, permettant ainsi leur élevage comme animaux modèle de laboratoire. Les différences observées entre la souris mdx et les patients DMD peuvent être expliquées par deux hypothèses. La première serait que la souris compense l’absence de dystrophine par l’utrophine, homologue autosomale de la dystrophine (80 % d’homologie) (De La Porte et al, 1999). Une double déficience en utrophine provoque des caractéristiques phénotypiques plus sévères et plus similaires à celles observées chez les patients DMD (Deconinck et al, 1997). La seconde hypothèse serait que les cellules satellites des souris pourraient avoir un potentiel régénératif plus élevé (Grounds et McGeachie, 1992).

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b) La dystrophie musculaire canine

Chez les chiens, la pathologie a été observée chez les golden retrievers, les terriers irlandais, les samoyèdes et les rottweilers. Chez ces animaux, la mutation est une transition A en G près de la fin de l’intron 6 ce qui entraine un défaut d’épissage. L’exon 7 est ainsi perdu et le cadre de lecture est perturbé, ce qui entraine un codon stop prématuré. En 1973, de Lahunta décrivit pour la première fois, chez deux chiens golden retriever, une myopathie apparue de manière spontanée. Il observe que la musculature temporale et du tronc dégénère de manière importante. Des études électromyographies révèlent des activités importantes en haute fréquence et des libérations répétitives caractéristiques de la pseudomyotonie. Les troubles sont progressifs avec une dégénérescence musculaire continuelle, une faiblesse progressive, un élargissement de la base de la langue et une augmentation des niveaux de créatine kinase. De plus, Valentine et al (1992) montrent que les fibres musculaires squelettiques de ces chiens sont nécrosées et remplacées progressivement par du tissu fibreux causant ainsi une atrophie musculaire (figure 7). Dans ce modèle animal, la dystrophie musculaire est plus sévère que chez la souris mdx, mais bien que ce modèle soit plus proche du phénotype des patients DMD, il est peu pratique pour l’expérimentation en raison des contraintes d’élevage et des problèmes d’éthique.

Figure 7 : Photographie du chien GRMD,

Ces photographies montrent l'évolution de la pathologie chez le modèle canin de la DMD. (A) chien âgé de 3 mois ; (B) même chien mais âgé de 6 mois. En 3 mois, une raideur des muscles pelviens, des contractures articulaires et une hyperextension des pattes sont observées (D’après Kornegay et al, 1994).

c) La dystrophie musculaire féline

Les dystrophies chez les chats sont plus rares et les symptômes sont observés durant leur première ou leur deuxième année de vie. Les chats atteints présentent un élargissement musculaire, une langue proéminente, une mobilité affectée et des signes de cardiomyopathie. Sur des coupes de muscles, des amas de fibres musculaires nécrotiques et un faible marquage pour la dystrophine sont observés (Gaschen et al, 1992). Le site de mutation n’a pas été identifié à ce jour.

d) Les lignées cellulaires

Les lignées appelées SolC1(-) sont dépourvues de dystrophine. Leur utilisation permet l’étude et la compréhension de la mise en place des mécanismes précoces conduisant au phénotype DMD. Cette lignée a été obtenue à partir de la lignée myogénique Sol8 qui a été isolée à partir du muscle soléaire de souris normales C3H (Mulle et al, 1988). Après plusieurs clonages successifs par dilution limite, la lignée Sol8 a perdu l’expression de la dystrophine donnant ainsi lieu à la lignée SolC1(-).

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F.

Physiopathologie

a) Généralités

Les biopsies musculaires des patients DMD (figure 8) montrent de manière caractéristique des fibres musculaires nécrotiques ou dégénérées, souvent observées en clusters. Les fibres nécrotiques sont entourées par des macrophages et des lymphocytes CD 34+. Des petites fibres immatures, centronuclées, sont également observées, ce qui reflète la régénération musculaire à partir des myoblastes (Shmalbruch et al, 1984 ; McDouall et al, 1990). Il y a donc une balance entre les processus nécrotiques / régénératifs dans la phase précoce de la maladie. Plus tardivement, la capacité régénérative du muscle apparait être épuisée et les fibres musculaires sont progressivement remplacées par du tissu conjonctif et adipeux.

Figure 8 : Biopsie de muscle d'un patient DMD

Cette biopsie montre des fibres musculaires nécrotiques et dégénératives (flèches), souvent observées en clusters, entourées par des macrophages et des lymphocytes CD34+ (étoiles). Des petites fibres centronuclées immatures sont également présentes (double étoiles), reflétant la régénération musculaire. (D’après Deconinck et al, 2007).

Par conséquent, les manifestations de la DMD sont considérées comme résultant du déséquilibre entre nécrose des fibres musculaires et régénération myoblastique, le premier paramètre étant la nécrose bien que les études sur les animaux semblent suggérer que la capacité régénérative doit diminuer avec l’âge (Bockhold et al, 1998).

b) Les quatre grandes hypothèses de la nécrose musculaire squelettique

Dans la myopathie de Duchenne, le lien entre l’absence de la dystrophine et la nécrose des cellules musculaires n’est pas encore bien compris. Cependant, afin d’expliquer les phénomènes de nécrose dans le muscle squelettique, quatre grandes hypothèses ont été avancées (Deconinck et al, 2007).

i. L’hypothèse mécanique

Nous avons précédemment développé dans le paragraphe sur les rôles du CAD, la théorie de la fonction mécanique du complexe. Dans la myopathie de Duchenne, l’absence du CAD à la membrane et, donc, l’absence de lien entre le cytosquelette et la matrice extracellulaire (MEC) entrainerait la fragilisation de l’intégrité du sarcolemme permettant ainsi le passage de molécules entre le milieu extracellulaire et le cytosol (Ozawa, 2010 ; Allen et al, 2010b). Ceci est soutenu par l’observation de concentrations élevées de protéines cytoplasmiques spécifique du muscle (comme la créatine kinase) retrouvées dans le sérum de patients DMD et de souris mdx (McArdle et al, 1995).

ii. L’hypothèse calcique

Les processus dégénératifs des cellules musculaires de patients DMD semblent impliquer

une surcharge cytoplasmique en calcium (Bodensteiner et Engel, 1978).

Physiologiquement, au repos, la concentration calcique cytosolique est de l’ordre de 100 nM pour les cellules musculaires. La dérégulation du calcium engendre alors une cascade d’évènements conduisant à la mort cellulaire. Néanmoins, la relation entre l’absence de la dystrophine et de son complexe associé et la surcharge cytosolique en ions Ca2+ n’est pas encore bien comprise et ne semble pas faire l’unanimité au sein de la communauté scientifique (pour revue, Allen et Whitehead, 2011). En effet, certaines études démontrent une augmentation globale de la concentration intracellulaire calcique au repos (Turner et al, 1988 ; Allen et al, 2010b). A l’opposé, d’autres auteurs ne rapportent aucune accumulation en ions Ca2+ dans les muscles de souris mdx ou de ceux de patients DMD (Gailly et al, 1993).

La question des voies d’entrées du calcium qui engendreraient cette surcharge cytosolique reste encore débattue. Plusieurs hypothèses sont suggérées :

• La dérégulation de canaux cationiques mécanosensibles, activés par l’étirement de la membrane (les Stretch-Activated Channels ou SACs) et des canaux calciques dépendant du voltage. Ces canaux ont été proposés comme candidats notamment dans le cas de la DMD (Imbert et al, 1996 ; Imbert et al, 2001 ; Vandebrouk et al, 2001 ; Allen et al, 2010a).

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• Les canaux TRPC (Transient Receptor Potential Canonical) seraient également impliqués, notamment TRPC1, localisé à la membrane, et qui serait un canal calcique capacitatif s’activant suite à la déplétion du réticulum sarcoplasmique, provoquant ainsi un influx calcique vers le cytoplasme. TRPC1 a été impliqué dans la surcharge calcique dans les fibres musculaires de souris mdx (Vandebrouk et al, 2002) et dans les myotubes DMD (Harisseh et al, 2013). De surcroit, son expression est augmentée d’un facteur 3 dans des cardiomyocytes de souris mdx âgées de 42 semaines, alors qu’elle reste inchangée chez les jeunes souris mdx (Williams et Allen, 2007).

• Dérégulation du réticulum sarcoplasmique (RS) avec dysfonctionnement de la SERCA (Sarco(Endo)plasmic Reticulum Calcium ATPase) et/ou une altération du RS à séquestrer le calcium (Lamb et Cellini, 1999). De plus, une fuite spontanée de calcium de RS a été observée chez les patients DMD (Deval et al, 2002) ce qui, par conséquent, augmenterait le phénomène de Calcium Induced Calcium Release (CIRC).

• Suractivation de la voie IP3 : le taux basal d’IP3 est doublé et les libérations spontanées des récepteurs à l’IP3 plus fréquentes (Balghi et al, 2006 a et b ; Mondin et al, 2009).

L’hypothèse calcique sera détaillée dans la partie II, D, dans le contexte de la cardiomyopathie dilatée.

iii. L’hypothèse vasculaire

Au départ, l’hypothèse de défauts au niveau de la vascularisation des fibres musculaires avait été émise dans le cas de la DMD en raison de la formation en clusters des fibres nécrotiques. Cependant, des études structurales des vaisseaux sanguins n’ont montré aucune anormalité (Koelher, 1977). Une attention, plus récente, est portée sur le rôle local que pourrait jouer le monoxyde d’azote (NO). En effet, parmi les différentes protéines composant le DGC, on retrouve l’enzyme NO synthase neuronale (nNOs). Cette enzyme permet la synthèse du NO dans les cellules musculaires. Ce gaz induit une dilatation locale des vaisseaux sanguins ou vasodilatation, qui augmente l’apport d’oxygène et de nutriments nécessaires au muscle lors d’un exercice physique (Wink et al, 1995). La déstabilisation du complexe associé à la dystrophine dans le cas de la DMD entraine une délocalisation de la nNOs qui se retrouve ainsi libre dans le cytoplasme (Bia et al, 1999). Par conséquent, la production de NO serait diminuée, provoquant un manque d’oxygénation (ischémie) du muscle lors de la contraction. Cependant, des études menées sur des souris knockout nNOS montrent que celles-ci ne développent pas de pathologie musculaire. Les double mutants nNOS/mdx présentent, quant à eux, un phénotype différent des cellules musculaires de

souris mdx (Huang et al, 1993 ; Crosbie et al, 1998). Ceci suggère donc que la nNOs ne jouerait pas un rôle direct dans la pathogénèse DMD, mais elle pourrait contribuer à accentuer les lésions que subissent les fibres musculaires.

iv. L’hypothèse inflammatoire et du stress oxydatif

Des études ont montré que les patients DMD souffraient d’une réponse inflammatoire chronique (Haslett et al, 2002). L’utilisation de corticostéroïdes a permis de ralentir la progression de la maladie, la prolongation de l’ambulation ainsi que la prévention du développement de la scoliose (Merlini et al, 2003 ; Yilmaz et al, 2004).

D’autres études favorisent une dernière hypothèse : le stress oxydatif. En effet, chez les patients DMD, l’oxydation des protéines semblerait augmentée (Allen et al, 2010a) et cette oxydation serait à l’origine de dommages sur l’ADN (Ragusa et al, 1997). Des traitements antioxydants ont été testés sur la souris mdx et se sont révélés bénéfiques. Néanmoins, les essais chez les patients DMD n’ont pas été concluants (Bäckman et al, 1988).

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G.

Les thérapies

A ce jour, les travaux de recherche n’ont pas pu conduire à une thérapie permettant d’empêcher la progression de la pathologie. Il existe actuellement différents axes de recherche.

a) La thérapie par médication i. Les corticostéroïdes

Les thérapies par les stéroïdes tels que le prednilosone, le prednisone ou le deflazacort (un dérivé du prednisolone) sont usuellement prescrites aux patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne et sont de loin les traitements pharmaceutiques les plus efficaces dans le ralentissement de la progression de la pathologie (Yiu et Kornberg, 2008). Leurs effets sont cependant transitoires et ce type de médicaments est associé à de nombreux effets secondaires comme des problèmes gastro-intestinaux, des désordres nutritionnels et métaboliques, des perturbations du système nerveux central et périphérique ainsi que des désordres psychiatriques. Les études, sur des souris mdx, ont montré que le prednisone et le prednisolone ont des effets anti-inflammatoires (Wehling-Henricks et al, 2004). De manière fonctionnelle, le prednisolone augmenterait la force spécifique du muscle squelettique mais pas sa fonction après des lésions des contractions excentriques et n’aurait pas d’influence sur la régénération des fibres. Le deflazacort stimulerait une augmentation de la réparation myogénique et de la différenciation musculaire (Anderson et al, 2000) et pourrait également diminuer la pathologie musculaire squelettique (Lim et al, 2004).

ii. Les co-traitements stéroïdes/nutriments

Le type de co-traitement stéroïde / nutriments est un axe de recherche important dans les thérapies pharmacologiques car il pourrait permettre de diminuer le dosage des corticostéroïdes et ainsi diminuer les effets secondaires. Dans une étude, des auteurs ont co-administré du prednisone avec du butyrate d’arginine, l’acide butyrique de l’acide aminé arginine. Les résultats montrent des changements important de l’expression de gènes impliqués dans la progression de la pathologie tels que ceux de l’inflammation, la fibrose, la croissance musculaire et la régénération (Lim et al, 2004). Différents tests d’association de la taurine, un acide aminé impliqué dans l’excitabilité membranaire et la régulation calcique, avec le prednisone montrent une augmentation de la force de la patte avant chez la souris mdx ainsi qu’une amélioration du seuil mécanique des fibres du long extenseur des orteils mais sans amélioration de la pathologie musculaire squelettique (Cozzoli et al, 2011).

Les résultats les plus probants ont été obtenus en combinant quatre nutriments (le monohydrate de créatine, l’acide linoleique, l’acide alpha-linoique et le béta-hydroxyl –