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Etude complémentaire : effet du poloxamer 188 sur les réponses calciques à

Le poloxamer ou acide pluronique P188 appartient à la famille des copolymères tribloc et possède une structure poly(ethyleneoxyde)-poly(propyleneoxyde)-poly-(ethyleneoxyde) (PEO-PPO-PEO). Cette molécule (faiblement toxique) a retenu l’attention pour la thérapie des cardiomyopathies parsa capacité à réparer les membranes (Wu et Lee, 2009). Le P188 a également montré son efficacité dans le contexte de la CMD associée à la DMD de par ses propriétés de réducteur de tension membranaire. En effet, Yasuda et al (2005) ont démontré que le traitement avec 150 µM de P188 restaure complètement la compliance des cardiomyocytes mdx et diminue les niveaux élevés de [Ca2+]i dans ces cellules. De plus, des études avec la sonde lipophile FM1-43, utilisée pour observer les microruptures du sarcolemme, ont montré qu’un étirement augmentait l’intensité de fluorescence de la sonde dans les cardiomyocytes mdx et que le traitement avec le P188 prévenait cette augmentation, suggérant ainsi la réparation des lésions membranaires. Des résultats similaires ont également été observés dans les travaux de Fanchaouy et al (2009) sur des cardiomyocytes mdx soumis à un choc hypoosmotique.

Dans notre étude, nous n’avons pas pu détecter les lésions membranaires en microscopie confocale. Cependant, ces observations ne signifient pas que ces microruptures ne soient pas présentes. Dans notre étude le P188 a été testé sur la mesure des influx cationiques et sur l’augmentation de [Ca2+]i pendant l’étirement axial (figure 68). Dans les cardiomyocytes WT, la présente de 150 µM de P188 ne modifie pas les influx cationiques (de 25 ± 3 %/min (n = 14) à 22 ± 4 %/min (n = 6)). Par contre dans les mdx, l’incubation en présence de cette même concentration de P188 induit une diminution significative des influx cationiques (de 49 ± 7 %/min (n = 14) à 28 ± 2 %/min (n = 5)) (figure 68 A). Dans les cardiomyocytes WT, l’incubation en présence de 150 µM de P188 ne modifie pas l’amplitude maximale de l’augmentation [Ca2+]i en condition d’étirement (de 1,5 ± 0,2 a.u. (n = 10) à 1,2 ± 0,2 a.u. (n = 6)) (figure 68 B). De manière similaire, dans les cardiomyocytes mdx, la présence de P188 ne modifie pas significativement cette amplitude (2,4 ± 0,1 a.u. (n = 12) à 2,8 ± 0,2 a.u. (n = 5)).

Figure 68 : Effet du P188 sur les influx cationiques et sur la [Ca2+]i.

Les cellules sont maintenues en étirement axial (contrôle : barres blanches) et ont été mises en présence de 150 µM de P188 (barres grises). (A) Représente la moyenne de la pente de l’extinction de fluorescence au point isosbestique de 360 nm et exprimé en % de diminution par minute. (B) Représente la moyenne de l’amplitude maximale de la sonde fluo-8, en A.U. * p < 0.05 ; ns : non-significatif. Les indications de significativité correspondent à une comparaison avec le contrôle.

Ainsi le P188, de part ses propriétés d’insertion dans la membrane et de réduction de tension membranaire, peut avoir deux effets : d’une part, il peut permettre la diminution des microruptures par l’augmentation de la fluidité de la membrane mais il peut, d’autre part, avoir un effet modulateur de l’activité de canaux mécanosensibles en diminuant les contraintes physiques (tension) autour de ces canaux. Dans notre étude, le fait que le P188 inhibe les influx dans les cardiomyocytes mdx uniquement suggère que les canaux responsables de cet influx puissent être modulés par les tensions de la membrane environnante. Dans ce cas, les TRPV2 étant majoritairement impliqués dans l’influx dans les cardiomyocytes mdx, ces canaux pourraient perdre de leur capacité mécanosensible dans une membrane rendue plus fluide par le poloxamer.

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Conclusion générale et perspectives

Dans cette étude, un des premiers objectifs techniques fut de mettre au point un système d’étirement le plus représentatif possible de conditions d’étirement physiologique. Différentes méthodes de stimulation ont été publiées telles que l’utilisation de micropipettes de patch- clamp polies, de substances adhésives ou encore l’application d’un choc hypoosmotique. Cependant, les deux premières méthodes nécessitent des outils techniques importants. De plus, ces procédés endommagent la membrane des cellules, ce qui rend difficile les expérimentations. La troisième technique, le choc hypoosmotique, qui entraine l’augmentation du volume cellulaire par entrée d’eau a été largement utilisé. Cependant, cette méthode entraine un étirement de l’ensemble du sarcolemme, ce qui ne correspond pas au contexte physiologique du remplissage ventriculaire en fin de diastole. De surcroit, l’entrée d’eau et l’activation de courants dépendants de l’osmolarité (par exemple les courants ICl swell) peuvent entrainer des modifications électrophysiologiques qui ne dépendent

pas de l’activation de canaux mécanosensibles. Toutes ces considérations ont été prises en compte pour déterminer la méthode la plus adaptée pour notre travail et c’est pour cela que nous avons choisi la technique des microfibres de carbone. Ce procédé possède l’avantage de maintenir une intégrité de la membrane car les fibres adhèrent de manière électrostatique à la cellule. Ceci permet de réaliser un étirement axial homogène de l’ensemble de la cellule, ce qui peut ainsi mimer les conditions physiologiques de fin de diastole. La fabrication des tiges de maintien des fibres n’a pas été aisée, néanmoins le protocole élaboré par Sugiera et al (2006) a permis de créer un système fiable et relativement facile de fabrication. La manipulation et l’adhésion des fibres a été délicate car les fibres de 40 µM sont assez rigides, se cassent facilement et une approche trop rapide et brutale entraine l’écrasement et la destruction des cardiomyocytes. Mais la patience et l’expérience ont permis, au final, de réaliser un étirement axial homogène et sans léser les membranes cellulaires.

La première partie de cette thèse a été consacré à l’étude des effets de l’étirement sur la surface membranaire des cardiomyocytes déficients en dystrophine. La fragilité membranaire induite par l’absence de la dystrophine et de son complexe associé entrainerait la formation de microlésions qui laisseraient ainsi traverser des ions et des molécules de plus grandes tailles dans le cytoplasme des cellules musculaires. Grâce à l’association de la microscopie de conductance ionique à balayage et du système d’étirement, la topographie membranaire a pu être évaluée. Cependant, aucune modification de la surface en fonction de l’amplitude d’étirement n’a pu être mise en évidence, même si une tendance à

l’augmentation du motif de régularité (crêtes et sillons) est observée sur les cardiomyocytes mdx. Il semblerait que les effets attendus de l’étirement soient retransmis au niveau de zones internes telles que les tubules T (McNary et al, 2011). Or, dans dans une étude précédente au laboratoire (Lorin et al, 2013), il a été montré une désorganisation du réseau de tubules dans les cardiomyocytes mdx au repos. La compensation des effets de l’étirement pourrait être alors altérée modifiant ainsi la mécanotransduction dans ces cellules.

Un autre aspect des effets de l’étirement sur la membrane a été abordé : les microruptures membranaires. En effet, il a été observé que la [Ca2+]i était élevée dans les cellules musculaires dystrophiques. Deux hypothèses ont alors été énoncées pour expliquer ce phénomène. La première hypothèse serait la présence de microruptures membranaires qui permettraient le passage d’ions, notamment le Ca2+, et de plus grosses molécules vers le cystosol. Plusieurs études ont rapporté la présence de ces évènements dans les cellules musculaires squelettiques dystrophiques et plus particulièrement, à la suite de contractions excentriques. Au niveau des cellules cardiaques, Fanchaouy et al (2009) ont mis en évidence ces lésions à la suite d’un choc hypoosmotique. Dans cette étude, nous avons essayé de détecter des anomalies de la membrane en condition d’étirement axial mais malgré un nombre important d’expérimentations, aucune microrupture ni augmentation consécutive de [Ca2+]i n’a pu être détectée. Ces résultats ont mené à la conclusion que ces événements devraient être trop rapides et trop petits pour être observés en microscopie confocale. Nous avons donc écarté l’hypothèse que l’augmentation de la [Ca2+]i dans les cellules dystrophiques étaient uniquement dues à l’influx de Ca2+ par ces microruptures.

La seconde partie de ce projet fut donc consacrée à l’étude de la seconde hypothèse, la dérégulation des canaux membranaires dont les canaux activés par l’étirement. Les premières expériences ont montré un résultat inattendu : la présence d’un influx cationique constitutif dans les cardiomyocytes mdx au repos, sans étirement. Les expérimentations réalisées au repos ont permis dans un premier temps, de montrer une activation constitutive des canaux dépendants de la déplétion des réserves de Ca2+ dans les cardiomyocytes mdx. Dans un second temps, de montrer que cet influx anormal implique les canaux TRPV2 qui, à l’origine, ne participent pas aux entrées induites par la déplétion des stocks (SOCE) contrairement aux TRPCs, également impliqués dans cet influx constitutif. De plus, il a été observé que la régulation de ces deux types de canaux passait par deux voies de signalisation distinctes : la voie de la PI3K pour les canaux TRPV2 et la voie de la PKC pour les TRPCs, sachant que cette dernière voie n’est pas impliquée dans le processus physiologique de SOCE. L’hypothèse serait alors que l’augmentation de la [Ca2+]i dans les cardiomyocytes mdx induirait l’activation des voies de signalisation dépendantes de la PKC

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et de la PI3K. Ces deux voies de signalisation seraient à l’origine d’un rétrocontrôle positif qui augmente l’influx de Ca2+ du milieu extracellulaire vers le cytosol, indépendamment de l’état de remplissage du RS et de l’activation du processus SOCE. La voie de la PKC induit la phosphorylation et l’activation des TRPCs alors que la PI3K augmenterait la translocation au sarcolemme et/ou l’activation des canaux TRPV2. Il serait interessant d’approfondir ces hypothèses par exemple, en étudiant l’activité de la PI3K dans les cardiomyocytes mdx grâce

à un kit de mesure d’activité. De plus, nous avons montré dans notre modèle âgé mdx que les canaux TRPV2 étaient transloqués à la membrane alors qu’ils se situent majoritairement dans les compartiments intracellulaires dans les cellules WT. Il existe donc une délocalisation des canaux TRPV2 dans les cardiomyocytes mdx et cette disparité pourrait s’expliquer par une maturation différente de ces canaux, observée en Western blot. La délocalisation des canaux TRPV2 pourrait expliquer leur comportement anormal dans les cellules dystrophiques. Mais une question reste en suspens : pourquoi ces canaux se délocalisent-ils ? Il serait donc intéressant d’étudier les voies de translocation. Plusieurs études indiquent que la PI3K serait impliquée dans la translocation de ces canaux.

Cependant, les études restent controversées car des travaux démontrent également que cette protéine régulerait l’activité de ces canaux mais n’interviendrait pas dans sa translocation à la membrane (Penna et al, 2006). Des immunomarquages pourraient être réalisés après activation de la PI3K par l’IGF-1 qui peut entrainer l’activation de cette voie

(Kanzaki et al, 1999) dans les cardiomyocytes WT afin d’observer ou non la translocation des canaux TRPV2 à la membrane. Une autre protéine a été proposée pour amener les canaux TRPV2 à la membrane, les protéines RGA (Recombinase gene activator). Il serait donc intéréssant d’étudier leur expression et leur activité dans le contexte de la DMD. De plus, cette différence de localisation semble précéder le développement de la CMD (installée à 10 mois) car des immunomarquages de souris mdx de 4 mois présentent déjà cette situation anormale des canaux TRPV2 (Lorin et al, 2015). Il semblerait pertinent d’observer si ces canaux sont délocalisés dès le stade néonatal ou si cela se réaliserait de manière progressive. En effet, une étude a montré que ces canaux se situaient au niveau des disques intercalaires des cardiomyocytes et qu’ils participeraient à leur formation et au maintien de leur intégrité (Katanosaka et al, 2014). S’il s’avérait que ces canaux n’occupent plus leur place originelle, il serait également intéressant d’étudier la transduction du signal au niveau de ces zones particulières.

L’étirement axial a permis d’observer les effets du stress mécanique induit par le remplissage ventriculaire. Les premières observations ont montré une différence de réponse entre les cardiomyocytes WT et mdx. En effet, l’étirement axial induit des influx cationiques plus importants dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine. Ces influx excessifs

pourraient être dus à la dérégulation de canaux membranaire tels que les SACs dont nous avons montré l’implication dans les réponses induites par l’étirement. Plusieurs candidats moléculaires de ces canaux ont été proposés tels que les canaux TRPC1 dont l’expression est fortement augmentée dans les cardiomyocytes mdx âgés (Ward et al, 2008), les canaux TRPC6 également proposé comme étant mécanosensibles, et les canaux TRPV2 dont la localisation sarcolemmale a été observée dans cette étude, sur ce modèle âgé de déficience en dystrophine. L’influx anormal, induit par ces canaux, pourrait conduire à l’augmentation plus rapide de la [Ca2+]i, phénomène que nous avons observé dans nos expériences. Afin d’approfondir cette hypothèse, il serait pertinent d’étudier de manière spécifique ces canaux et d’observer si le délai de réponse et si le temps de montée à l’amplitude maximale sont comparables aux cardiomyocytes WT. Par exemple, la technique des siRNA contre les canaux TRPC1, TRPC6 et TRPV2 pourrait être utilisée. Dans cette étude, nous avons utilisé un anticorps spécifique des canaux TRPV2 dirigé contre un épitope extracellulaire, il faudrait donc utiliser le même type d’anticorps, mais cette fois-ci dirigé contre les canaux TRPC1 ou TRPC6. Il serait également intéressant d’observer si la localisation de ces canaux TRPC1 et TRPC6 est aussi sarcolemmale. De surcroît, une autre étude sur les canaux TRPC1 pourrait être proposée. En effet, dans la partie « état de l’art » nous avons discuté de la mécanosensibilté de ces canaux : est-elle directe ou indirecte ? Des études ont proposé que la sensibilité mécanique puisse être médiée par une autre protéine, Homer 1 (Stiber et al, 2008). L’expression de cette protéine intracellulaire a été montrée diminuée dans les myocytes squelettiques mdx. De plus, sa déficience entraine une surcharge calcique et les souris Knock out pour Homer 1 présente une myopathie avec une diminution de la force du muscle squelettique. De surcroît, l’augmentation de l’influx calcique dans ce type de souris est supprimée par l’extinction du gène de TRPC1. Il serait donc intéressant d’étudier l’expression et l’activité de cette protéine dans les cardiomyocytes mdx.

Ces influx, que nous avons observés, non seulement sont en partie à l’origine de l’élévation de la [Ca2+]i mais participeraient également à la stimulation du CICR, déjà exacerbé dans les cellules dystrophiques (Ullrich et al, 2009). L’étude de l’implication des SACs a montré leur contribution dans ces influx. Nous pouvons supposer que l’origine des autres influx sont l’activation des SOCs qui induisent l’entrée constitutive dans le cas des cellules mdx et le processus de SOCE qui s’est activé après déplétion du RS dans le cas des cardiomyocytes WT. Cette dernière hypothèse est supportée par l’absence de contribution des SACs dans l’augmentation de la [Ca2+]i. En effet, celle-ci semble dépendre majoritairement de la libération de Ca2+ par le RS. De plus, l’inhibition des TRPCs, fortement impliqués dans le phénomène SOCE, diminue très fortement la [Ca2+]i uniquement dans les cardiomyocytes WT. Afin d’étayer cette hypothèse, le TPEN, chélateur de Ca2+ du RS, pourrait être utilisé

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dans les mesures des influx en condition d’étirement axial et en présence de l’inhibiteur des canaux TRPCs (YM). Ainsi, si l’YM n’a plus d’effet d’inhibition sur les influx en condition d’étirement, cela pourrait signifier que les TRPCs sont uniquement impliqués dans un processus de SOCE, activé secondairement à l’étirement.

Dans les cardiomyocytes mdx, il semblerait que se soient les canaux TRPV2 qui sont majoritairement impliqués. En effet, leur bloquage spécifique diminue significativement l’effet de l’étirement axial sur les influx et sur l’augmentation de la [Ca2+]i tandis que dans les cardiomyocytes WT, leur inhibition ne modifie pas les entrées et peu l’augmentation de la [Ca2+]i. De plus, l’activation de ces canaux avec le probénécide ne modifie ni les entrées cationiques, ni l’augmentation de la [Ca2+]i dans les cardiomyocytes mdx alors qu’elle augmente ces deux paramètres dans les cardiomyocytes WT. Nous avions observé, au repos, que le probénécide induisait une augmentation des influx uniquement dans les cardiomyocytes mdx et une élévation de la [Ca2+]i dans les deux types de cellules. Cependant, le mécanisme d’action du probénécide est encore méconnu et comme nous avons pu l’observer dans l’étude sur l’influx constitutif que sa/ses cibles sont différentes de celles d’un autre activateur, le THC. Il faudrait approfondir son mécanisme d’action : cette molécule cible t-elle directement les canaux TRPV2 ou agirait-elle sur des voies de signalisation comme celle de la PI3K, impliquée dans l’activation de ces canaux ?

L’ensemble de ces résulats suggèrent donc que dans les cardiomyocytes WT, les canaux TRPV2 seraient stimulés secondairement à l’étirement. L’augmentation de la [Ca2+]i pourrait activer ces canaux, indépendemment du processus SOCE auquel ils ne semblent pas contribuer. Dans les cardiomyocytes mdx, ces expériences ont montré que les canaux TRPV2 se trouveraient dans un état suractivé. Il est important de noter que sur des cardiomyocytes isolés WT, ces canaux ne semblent pas impliqués directement dans la réponse en condition d’étirement mais que leur localisation membranaire dans les cardiomyocytes mdx pourrait leur donner cette sensibilité.

Nous avons réalisé une étude complémentaire sur l’effet du poloxamer 188 sur les infux et l’augmentation de la [Ca2+]i en condition d’étirement. Le P188 possède des propriétés d’insertion dans la membrane et de réduction de tension membranaire. Cette molécule permettrait la diminution des microruptures par l’augmentation de la fluidité membranaire mais pourrait également moduler l’activité de canaux mécanosensibles en diminuant les contraintes physiques autour de ces canaux. Dans notre étude, le fait que le P188 inhibe les influx dans les cardiomyocytes mdx uniquement suggère que les canaux dépendant de cet influx puissent être modulés par les tensions de la membrane environnante. Dans ce cas, les canaux TRPV2 étant majoritairement impliqués dans l’influx dans les cardiomyocytes mdx, ces canaux pourraient perdre de leur capacité mécanosensible dans une membrane rendue

plus fluide par le poloxamer. Ces expériences confirmeraient que les cardiomyocytes mdx seraient plus sensibles à une stimulation mécanique comparée aux cardiomyocytes WT.

L’ensemble de ces résultats montrent donc que les candidats moléculaires des SACs sont différents entre les conditions normales et pathologiques. En effet, les cardiomyocytes mdx impliquent les canaux TRPV2 et TRPCs alors que pour les cardiomyocytes WT, il semblerait que se soient principalement les canaux TRPCs bien que ces canaux puissent être des acteurs du processus de SOCE. Les effets de l’inhibition de ces canaux pourraient être simplement dûs à l’inhibition partielle de ce processus dans lequel ils sont impliqués. Cependant, nous avons choisis, dans cette étude, d’explorer les canaux TRPs comme candidats moléculaires pour les SACs et plus particulièrement les canaux TRPV2, TRPC1 et TRPC6. Néanmoins, il existe d’autres candidats moléculaires des SACs. En effet, des études récentes ont découvert de nouvelles protéines mécanosensibles, les piézo protéines. Cependant, à ce jour, aucune étude ne porte sur leur localisation dans les cellules cardiaques. Il serait donc pertinent d’étudier d’une part, leur présence dans les cardiomyocytes et d’autre part, si elles sont exprimées, leur niveau d’expression, leur localisation cellulaire et leur implication dans les influx excessifs observés dans les cardiomyocytes mdx.

Dans ce projet, nous avons mis en évidence des différences fonctionnelles dans les cardiomyocytes déficients en dystrophine, que se soit au repos ou en condition d’étirement. Cette diversité implique une délocalisation et une activité anormale de canaux. Cependant, le lien entre l’absence de dystrophine et le déplacement d’un compartiment à un autre de canaux n’est pas évident. La perturbation membranaire qui résulte de la déficience en dystrophine entraine la dérégulation de l’homéostasie calcique, ce qui pourrait perturber les voies de translocation des protéines et ainsi leur conférer une activité anormale.

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Annexe 1 Composition des milieux utilisés pour l’isolement