Différents composants pharmacologiques ont été identifiés comme modulateurs des SACs. La plupart sont non-spécifiques comme les ions gadolinium (Gd3+) et les antibiotiques amilorides et cationiques comme la streptomycine, l’insuline et la kanamycine. Cependant, il existe actuellement un agent pharmacologique qui semble beaucoup plus spécifiques des SACs, le GsMTx-4.
a) Le gadolinium
Les lanthanides, comme le gadolinium, sont fréquemment utilisés pour bloquer les SACs à des concentrations comprises entre 1 et 100µM. Le mécanisme d’action semble être multi- sites, impliquant le masquage des charges négatives de surface, les interactions qui altèrent les propriétés de la bicouche lipidique et le blocage de l’ouverture du canal. Des enregistrements en canal unitaire sur les oocytes de Xénope ont montrés que le Gd3+ induisait une diminution de la probabilité d’ouverture dose-dépendante, du temps d’ouverture et de l’amplitude des courants SACs (Yang et Sachs, 1989). Dans le cœur, ces ions peuvent bloquer les courants cationiques des SACs dans les cardiomyocytes atriaux (Zhang et al, 2000) et ventriculaires (Kamkin et al, 2000 ; Zeng et al, 2000 ; Kamkin et al, 2003) de différentes espèces de mammifères. De plus, le Gd3+ peut bloquer les courants cationiques activés par l’augmentation du volume cellulaire (Clemo et al, 1998). Cependant, des études ont montré que le gadolinium pouvait bloquer d’autres courants dans des cardiomyocytes de mammifères tels que ICaL (Lacampagne et al, 1994), ce qui entraine une diminution du CICR
et de la contraction (Ward et White, 1994). Les ions Gd3+ peuvent également inhiber les courants sodiques et IKr (composante rapide de la rectification retardée) sans affecter IKs
(composante lente de la rectification retardée) et IK1 (courant entrant rectifiant) (Pascarel et
al, 1998). De plus, il semblerait que le Gd3+ bloquerait l’échangeur NCX (Zhang et Hancox, 2000).
b) Les antibiotiques aminoglycosidiques
Les antibiotiques aminoglycosidiques sont fait de 2 (ou plus) amino-sucres reliés à l’hexose par des liaisons glucosidiques et peuvent bloquer les canaux mécanosensibles dans beaucoup de types cellulaires (Hamill et Mcbride, 1996). Les antibiotiques comme la streptomycine peuvent bloquer les SACs dans les cellules musculaires de poulet (Sokabe et al, 1993) et de souris (Winegar et Lansmann, 1996) et les auteurs suggèrent que l’inhibition des SACs se ferait par un blocage partiel du pore. Le blocage de ces canaux par la streptomycine pourrait réduire les lésions musculaires induites par un étirement de souris
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mdx (Yeung et Allen, 2004 ; Yeung et al, 2005) et la dépolarisation induite par les contractions excentriques dans le muscle de rat (McBride et al, 2000).
Dans le cœur, les antibiotiques aminoglycosidiques ne sont pas spécifiques et peuvent également bloquer les canaux calciques et potassiques (Hino et al, 1982 ; Belus et White, 2001) et les canaux calciques de type L (pour des concentrations supérieures à 50µM) (Haws et al, 1996). Les effets de ces antibiotiques sont voltage et Ca2+ dépendants (Lullmann et Schwarz, 1985 ; Belus et White, 2001). Des travaux ont également montré, sur des cardiomyocytes ventriculaires de cobaye, que la streptomycine pouvait réverser l’augmentation de [Ca2+]i suite à un étirement axial (Gannier et al, 1994).
Pendant longtemps, les milieux de culture contenaient ce type d’antibiotiques (par exemple, la streptomycine à la concentration de 100mg.L-1 qui correspond à 69 µM). Mais, depuis que leurs effets ont été identifiés sur les SACs, ces agents ont été retirés des milieux. Cependant, les effets sur du court terme semblent réversibles alors que pour le long terme, la réversibilité est moins certaine (McBride et al, 2000 ; Yeung et al, 2005).
c) Le GsMTx-4
Le GsMTx-4 est un peptide de 4 kDa isolé à partir du venin de tarantule (Grammostola rosea). Cette molécule s’intégrerait dans la couche lipidique externe (partie hydrophobe) et les régions chargées du peptide détermineraient probablement la pénétration en profondeur dans la bicouche (Bowman et al, 2007). L’insertion se réaliserait à proximité du canal, relâcherait la tension lipidique et favoriserait l’état fermé du canal. Il ne bloquerait pas spécifiquement les SACs mais agirait sur la membrane car les énantiomères D et L du peptide sont capables de bloquer les SACs (Suchyna et al, 2004).
Le GsMTx-4 serait capable de bloquer les piézo protéines de type 1 (Bae et al, 2011). De plus, des études sur des systèmes hétérologues et ‘in situ’ ont permis de lier directement les effets du GsMTx-4 avec l’inhibition des canaux TRPC1 et C6 (figure 27). Dans le cœur, Williams et Allen (2007) ont observé que le GsMTx-4 réduirait de manière chronique les niveaux élevés de Ca2+ au repos dans les cardiomyocytes ventriculaires de souris mdx montrant ainsi une implication des canaux mécanosensibles dans cette élévation de [Ca2+]i au repos. De surcroit, cette étude et celle de Ward et al (2008) ont montré des niveaux de TRPC1 augmentés dans ces cardiomyocytes. Bien que ces résultats suggèrent un lien direct avec les canaux TRPs étudiés qui seraient la seule source de la [Ca2+]i aberrante, une attention doit être portée aux résultats obtenus dans les systèmes hétérologues car les conclusions sont seulement supportées par des preuves indirectes ‘in situ’. De plus, les canaux TRPs ne sont pas les seuls candidats d’une manière générale et le GsMTx-4 est supposé spécifique des SACns.
Figure 27: Effet du GsMTx-4 sur les canaux TRPC6.
Modèle de l’activation des canaux TRPC6 par l’étirement (à gauche) ou par le DAG (à droite) dans la membrane et son inhibition par le GsMTx-4. L’activation mécanique implique un amincissement de la membrane et l’ouverture du canal est bloqué par l’insertion du GsMTx-4 dans le feuillet externe ce qui modifie la tension membranaire à proximité du canal. L’activation par la PLC clive le PIP2 en DAG (et IP3) qui va à son tour modifier la courbure de la membrane pour ouvrir TRPC6. Le GsMTx-4 est supposé relâcher cette courbure induite par le stress (D’après Spassova et al, 2006).
d) Les autres modulateurs
TREK-1 est faiblement sensibles aux inhibiteurs classiques des autres canaux potassiques (Lotshaw, 2007), mais il peut être modulé par une diversité d’agents pharmacologiques comme les anesthésiques volatiles, le riluzole, la fluoxetine et la spadine. Récemment, une équipe a mis en évidence de nouveaux modulateurs et plus particulièrement des activateurs, qui sont rares pour les SACs (Bagriantsev et al, 2013). Les activateurs connus pour les SACs sont les substances amphipatiques qui s’insèrent de manière sélective dans la membrane, induisant localement, une courbure convexe ou concave, qui entrainerait une tension permettant d’ouvrir les SACs (Sheetz et Singer, 1974).
De plus, les canaux TRPV2 ont été proposés comme candidats moléculaires des SACs. A ce jour, plusieurs modulateurs de l’activité des canaux TRPV2 existent:
• Le probénécide qui serait un activateur de ces canaux. A l’origine, cette molécule est un médicament uricosurique prescrit dans le traitement de fond de la goutte. C’est un acide
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benzoïque hautement lipophile développé par Sharp et Dohme (sous le nom de bénémide, Beyer et al, 1950) pour diminuer l’excrétion rénale de la pénicilline. Depuis, ce médicament a été utilisée pour augmenter la concentration dans le sérum de plusieurs antibiotiques et antiviraux (Butler, 2005). De plus, le probénécide a été identifié comme inhibiteur compétitif des processus de transports actifs dans le cerveau (Korf et Praag, 1970), le foie (Kenwright et Levi, 1973) et les yeux (Forbes et Becker, 1960). Cependant, ses utilisations cliniques se limitent encore à ses effets rénaux.
Son action au niveau rénal a été étudiée par Roch-Ramel et Guisan (1999). Ces travaux ont montré que le probénécide aurait le rôle d’un inhibiteur compétitif du transporteur d’anions organiques (OAT – Organic anion transporteur) et que cette inhibition préviendrait la recapture de l’acide urique par l’OAT de l’urine vers le sérum.
L’intérêt pour le probénécide a récemment augmenté grâce à la découverte de son action potentielle et sélective sur les canaux TRPV2 (Bang et al, 2007). Cette étude, sur des cellules HEK-293T, a montré que le probénécide activerait les canaux TRPV2 d’une manière sélective. En effet, la stimulation des canaux TRPV1, TRPV3, TRPV4, TRPM8 et TRPA-1 avec cette molécule n’a généré aucune réponse. Au niveau du cœur entier, l’administration de probénécide induirait un effet inotrope et lusitrope positif et au niveau cellulaire, il stimulerait la contractilité par une action indirecte sur le RS (Kosh et al, 2012 ; Rubinstein et al, 2014). Dans ces études, les résultats obtenus sur des animaux TRPV2-/- a permis aux auteurs de supposer que cette molécule agirait directement sur les canaux TRPV2. Le probénécide serait donc un révélateur important de l’activité des canaux TRPV2 et agirait de manière relativement spécifique.
• Le tranilast qui serait un inhibiteur de ces canaux. C’est un dérivé de l’acide aminé tryptophane. A l’origine, le tranilast a été identifié comme un agent anti-allergique et utilisé dans le traitement des pathologies inflammatoires telles que l’asthme bronchique, la dermatose atypique, les conjonctivites allergiques et les cicatrices chéloïdes et hypertrophiques. L’effet bénéfique du tranilast a également été observé dans divers états pathologiques telle que la fibrose, les désordres prolifératifs, le cancer, les dysfonctions cardiovasculaires, les défauts auto-immuns, les pathologies oculaires, le diabète et les pathologies rénales. De plus, plusieurs essais cliniques ont montré ses peu d’effets secondaires et serait généralement bien toléré par les patients.
Ses cibles moléculaires ne sont pas encore bien connues, cependant des études démontrent son action sur la voie de signalisation du TGF-β (Transforming growth factor-
β). Ce membre de la famille des cytokines régule un nombre important de processus biologiques tels que la progression du cycle cellulaire, la prolifération, l’apoptose, la migration, la différentiation, l’immunorégulation, la tumorogénèse, l’angiogenèse et la
fonction endocrine. Le mécanisme d’action du tranilast sur cette voie n’est pas élucidé bien que ces effets inhibiteurs sur l’expression et/ou l’activité du TGF-β ont été démontrés dans de nombreux types cellulaires (Darakhshan et Pour, 2015). Une autre cible moléculaire connue est le canal TRPV2, dont l’implication dans des processus biologiques de divers tissus est connue. Par exemple, au niveau pancréatique, TRPV2 est régulé par l’insuline dans les cellules β et agirait comme un régulateur de l’entrée calcique via la voie de l’insuline. Le tranilast bloquerait la sécrétion d’insuline ainsi que l’entrée de calcium induite par l’insuline (Hisanaga et al, 2009). Cependant, l’association TRPV2/effets du tranilast n’est pas encore comprise bien que l’étude de Zhang et al (2012) suggère une inhibition spécifique des canaux TRPV2 dans le cadre de la dégranulation des mastocytes.
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Position du problème
Pendant longtemps, les recherches sur la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) se sont focalisées sur les muscles squelettiques en raison de la perte ambulatoire précoce des patients. Des traitements ont été mis en œuvre pour améliorer la qualité de vie des patients et permettre ainsi de prolonger leur durée de vie. Cependant, l’allongement de l’espérance de vie a démasqué d’autres symptômes, notamment au niveau cardiaque. En effet, au cours de l’adolescence, les signes d’une cardiomyopathie dilatée (CMD) se développent et cette pathologie entraine le décès de 20% des patients vers l’âge de 25 ans.
Après la découverte de l’origine de cette pathologie, c’est-à-dire des mutations sur le locus Xp21 du chromosome X qui entraine l’absence de son produit, la dystrophine, les études se sont portées sur le rôle que pouvait jouer cette protéine et ainsi faire le lien entre la déficience en dystrophine et la nécrose des cellules musculaires. Ces premières recherches ont permis d’établir que la dystrophine ferait le lien entre les éléments du cytosquelette et, via son complexe associé (CAD), avec la matrice extracellulaire. L’absence de la dystrophine déstabiliserait donc la membrane plasmique et cette fragilisation pourrait entrainer l’entrée massive d’ions calcium car plusieurs études ont rapporté un taux élevé de calcium intracellulaire dans les cellules musculaires dystrophiques. Dans les cellules cardiaques, cette perte de l’intégrité membranaire pourrait être d’autant plus importante que le cœur est un organe qui est en permanence soumis à un stress mécanique.
Plusieurs hypothèses ont été émises quant à l’augmentation des influx observés dans les cardiomyocytes dystrophiques. La première étant celle des microruptures membranaires. En effet, de premières études menées sur le muscle squelettique dystrophique ont mis en évidence des lésions (microruptures) du sarcolemme, particulièrement en condition de stress mécanique. Les niveaux de créatine kinase dans le sérum seraient plus élevés chez les patients DMD et chez les souris mdx, modèle murin de la DMD. Au niveau des cardiomyocytes, peu d’études rapportent de tels évènements et la stimulation mécanique appliquée a été réalisée en condition de stress hypo-osmotique qui provoque une augmentation du volume cellulaire (Fanchaouy et al, 2009). Mais, ces évènements sont-ils présents lorsque l’on soumet les cellules à un étirement axial comme lors d’un étirement diastolique ? Il semblait donc intéressant, dans un premier temps, d’explorer l’hypothèse de ces microruptures membranaires sur les cardiomyocytes mdx, et cela lorsqu’un étirement axial est réalisé. Pour cela, nous avons associés deux techniques : la microscopie de
conductance ionique à balayage (SICM) qui permet d’obtenir des images topographiques en haute résolution de la surface membranaire, et une technique d’étirement axial grâce à des microfibres de carbone. Nous avons utilisé les propriétés électrostatiques de ces fibres pour les attacher sur les cardiomyocytes et ainsi réaliser un étirement axial homogène et similaire aux conditions physiologiques de diastole.
Dans un second temps, nous nous sommes demandé quelles seraient les conséquences d’un étirement axial au niveau intracellulaire car il a été démontré que l’étirement axial induisait une augmentation de la [Ca2+]i. Existe-t-il des différences entre les cardiomyocytes WT et mdx? Dans ce but, nous avons mesurés, en microscopie confocale, les variations de [Ca2+]i grâce à la sonde fluo-8.
Cette augmentation de la [Ca2+]i pourrait être due aux influx cationiques activés lors d’un étirement. De plus, des travaux ont montré que ces entrées étaient augmentées dans les cellules cardiaques dystrophiques. Retrouvons-nous ces influx dans nos conditions d’étirement ? Sont-ils plus importants dans le cas de cardiomyocytes déficients en dystrophine? Pour cela, nous avons utilisé la technique d’extinction de fluorescence du fura- 2 par le Mn2+. Cette technique permet d’observer les influx cationiques car le Mn2+ a la propriété de traverser la membrane par les mêmes canaux que le calcium et éteint, au fur et à mesure de son entrée, la fluorescence du fura-2 chargé dans les cellules.
Ces expériences nous ont ensuite conduit à nous poser la question suivante : quels sont les acteurs impliqués dans ces influx ?
Cela nous a conduits à une hypothèse, autre que celle des microruptures, qui pourrait expliquer l’augmentation des influx cationiques dans les cellules dystrophiques, la dérégulation de canaux membranaires et plus particulièrement, les canaux activés par l’étirement (les stretch-activated channels – SACs). Les SACs sont des canaux qui peuvent être activés par la déformation de la membrane de manière directe ou indirecte. Depuis leur découverte en 1984, ils font l’objet de nombreuses études que ce soit sur les muscles, les neurones ou les cellules épithéliales ce qui a permis de mieux comprendre leurs propriétés telles que leur dépendance au voltage et à l’amplitude d’étirement. Ces canaux peuvent être perméables aux ions monovalents tel que le Na+ et le K+ ou divalents comme le Ca2+. Plusieurs études ont montré que l’étirement de la membrane, en condition physiologique, induisait des augmentations de la concentration intracellulaire de Ca2+ et de Na+. Les SACs ont été beaucoup étudiés sur le muscle squelettique dystrophique et ont été fortement impliqués dans les influx cationiques anormaux (Whitehead et al, 2006). Au niveau cardiaques, les études sont moins nombreuses mais toutes aussi pertinentes. En effet, des travaux ont montré que l’inhibition des SACs permettait de diminuer les niveaux de calcium
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de repos sur des souris mdx jeunes (Ward et al, 2008 ; Williams and Allen, 2007) ce qui implique ces canaux dans les stades précoces de la CMD. Dans ce projet, l’implication des SACs dans les influx cationiques et dans l’augmentation de la [Ca2+]i a été étudiée grâce à l’utilisation de deux inhibiteurs : la streptomycine, considérée comme non spécifique et le GsMTx-4, bloqueur le plus spécifique des SAC cationiques non-sélectifs (SACns) connu à ce jour.
Dans nos conditions, l’implication des SACs a été confirmée dans les réponses induites par l’étirement et la question suivante était donc: quels sont les candidats moléculaires des SACns ? Plusieurs travaux rapportent que certains membres de la famille des TRPs seraient impliqués dans la mécanosensibilité. Les canaux TRPC1 ont été les premiers à être suggérés. Leur expression est en effet augmentée dans les souris mdx et des travaux ont montré que leur inhibition diminuerait l’augmentation de calcium intracellulaire suite à un étirement que ce soit dans le muscle squelettique que dans le cœur. Les canaux TRPC6 ont également été suggérés. Dyachenko et al (2009) démontrent leur mécanosensibilité dans des cardiomyocytes de souris et Seo et al (2014) montrent que leur inhibition améliore le phénotype dystrophique. Enfin, de plus en plus d’études portent sur les canaux TRPV2 et sur leur implication dans les influx excessifs de la DMD. Les expériences sur les muscles squelettiques ou les cardiomyocytes dystrophiques adultes ont montré une accumulation de ces canaux sur la membrane plasmique (Iwata et al, 2003 et 2013 ; Lorin et al, 2015). Leur inhibition diminuerait les dommages engendrés par des contractions excentriques (Zanou et al, 2009) et la progression de la CMD (Iwata et al, 2013). En raison de leur implication dans des contextes pathologiques, plusieurs études se sont focalisées sur leur rôle physiologique dans les cellules cardiaques. Les auteurs ont ainsi montré que ces canaux se localisaient dans les disques intercalaires et qu’ils joueraient un rôle important dans la formation et le maintien de l’intégrité de ces disques et qu’ils interviendraient dans la mécanotransduction dans ces zones. De plus, les canaux TRPV2 prendraient part, de manière indirecte, au couplage excitation-contraction en favorisant une augmentation de la contractilité. Dans ce projet, nous avons donc exploré la contribution de ces trois candidats moléculaires dans l’augmentation de l’influx et dans l’augmentation de la concentration intracellulaire de Ca2+ suite à un étirement axial.
Ces travaux ont pour but d’explorer les possibles voies d’entrées de calcium en condition de stress mécanique qui induirait une concentration intracellulaire excessive de calcium. De plus, l’indentification d’acteurs moléculaires impliqués dans ces mécanismes permettrait mieux comprendre la pathogénèse conduisant à la mort des cellules musculaires.