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Délivré par l'Université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Cancérologie
JURY
Gilles Favre (président du Jury) Jean-François Peyron (Rapporteur)
Annie Molla (Rapporteur) Laurent Delva (Rapporteur) Bernard Payrastre (Directeur de thèse)
Laurent Créancier (Encadrant)
Ecole doctorale : Biologie-Santé-Biotechnologies Unité de recherche : INSERM U563 et CROE
Directeur(s) de Thèse : Bernard Payrastre et Christian Bailly
Rapporteurs : Noms des rapporteurs (s'ils ne font pas partie des membre du jury) Présentée et soutenue par Annelies Renner
Le 16 Décembre 2008
Titre : Mise au point de tests "preuve de principe" pour l’étude des inhibiteurs de la Plk1
et caractérisation de la Plk1 en tant que cible dans le traitement des Leucémies Aiguës Myéloïdes
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Délivré par l’Université Toulouse III - Paul Sabatier
Discipline ou spécialité : Cancérologie
Présentée et soutenue par Annelies Renner
Le 16 Décembre 2008
Titre : Mise au point de tests "preuve de principe" pour l’étude des inhibiteurs
de la Plk1 et caractérisation de la Plk1 en tant que cible dans le traitement
des Leucémies Aiguës Myéloïdes
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URYGilles Favre (Président du Jury)
Jean-François Peyron (Rapporteur)
Annie Molla (Rapporteur)
Laurent Delva (Rapporteur)
Bernard Payrastre (Directeur de Thèse)
Laurent Créancier (Encadrant)
Ecole Docorale : Biologie-Santé-Biotechnologies
Unité de Recherche : INSERM U563 et CROE
A Julien, pour sa patience.
A mes parents et à ma soeur, pour leur soutien dans les moments difficiles.
A tous ceux qui ont cru en moi.
REMERCIEMENTS
Je remercie le Professeur Gilles Favre de m’avoir fait l’honneur d’accepter la présidence du jury de cette thèse.
Je remercie les Docteurs Jean-François Peyron, Annie Molla et Laurent Delva d’avoir accepté de juger ce travail et d’y avoir consacré du temps.
Je remercie le Professeur Bernard Payrastre et le Docteur Laurent Créancier d’avoir accepter de participer à mon jury. Merci a tous les deux, ainsi qu’au Docteur Anna
Kruczynski, pour les heures (nombreuses !) consacrées à la correction de mon manuscrit.
Je remercie mes nombreux encadrants, les Docteurs Christian Bailly, Anna
Kruczynski et Laurent Créancier, pour m’avoir accueilli et dirigé mon travail depuis le
DESS, ainsi que le Professeur Bernard Payrastre et les Docteurs Nicolas Guilbaud et
Je tiens à remercier Jérôme Verdier et Sabine Roy pour leur amitié et pour tous les moments partagés, les coups de blues et les délires. Les longues discussions lorsque nous travaillions à deux avec Jérôme, mon colocataire de paillasse, me manqueront. Je remercie également Jérôme et Sabine pour leur soutien sans partage au cours de ces années de thèse.
Je remercie également Nathalie Gallay et Lucie Krzaczkowski pour leur aide et surtout pour leur amitié, qui a éclot au cours de cette thèse et qui devrait encore s’accroître dans le futur. Je suis honorée de vous avoir rencontré.
Je tiens à remercier Jéjé, Steph et Yoann pour m’avoir intégré à leur équipe en 2004, quand nous étions encore au château, à Péraudel. Je les remercie également pour m’avoir aidé dans mes manips au sein de ce nouveau (à l’époque !) laboratoire. Je remercie également les inséparables Marie-Laure et Vanessa (il m’aura fallu un moment pour mettre le bon nom sur le bon visage), ainsi que Nathalie C., Laurence, Caroline C., Sandrine, Aline,
Jean-Christophe, Christel, Jésahelle, Florence, Valérie F., Steph V., Isabelle V., Isabelle T. et Jacques, que j’ai rencontré à Castres, puis Natacha, Valérie C., Karine, Caroline D., Violaine, les nombreuses Nathalie, Vivianne, Frédéric, Patrice, Antoine, Bruno, Jean-Philippe et Emmanuel, que j’ai rencontré au cours de ma thèse.
D’autre part, je tiens à remercier Cédric, Jessica et Sophie pour m’avoir accueilli dans leur bureau et m’avoir intégré à la BP Team. Je remercie également les autres membres de l’équipe, Mathieu, Fabienne, Kelly, Frédéric, Valérie M., Damien, Anne V. et Anne
M., Gaëtan, Mélanie, Laurie, Cécile, Camille, Marie-Cécile, Claire, Frédérique, Hélène, Marie-Pierre. Merci à tous pour votre accueil.
Enfin, je tiens à remercier les personnes rencontrées au cours de ma thèse dans les services adjacents aux miens, Delphine, Nicolas, Denis, Céline, Thomas, Renaud, Cyndie,
Emilie-Fleur, Séverine, Joël, Pauline, Anne-Marie, Nicole, Monique, Aurore, Cécile D. et Christian R.. Merci à tous pour votre accueil.
TABLE DES MATIERES
ABREVIATIONS ... 4
LISTE DES FIGURES, TABLEAUX ET ANNEXES... 8
INTRODUCTION GENERALE... 11
INTRODUCTION GENERALE... 13
INTRODUCTION AUX POLO-LIKE KINASES... 13
I- Le cycle de division cellulaire ... 13
I-1 Généralités ... 13
I-2 Les différents régulateurs du cycle cellulaire ... 15
II-La famille des Polo-like kinases... 16
II-1 La découverte de la protéine Polo chez la Drosophile ... 16
II-2 Exemples de protéines de la famille Polo, très conservée au cours de l’évolution17 II-3 Les Polo-like kinases des mammifères ... 19
LA POLO-LIKE KINASE 1 ... 23
I- Structure et régulation de la Plk1 ... 23
I-1 Régulation transcriptionnelle du gène de la Plk1 ... 23
I-2 Les différents domaines de la Plk1... 25
I-2-1 Le domaine kinase... 25
I-2-2 Le domaine Polo Box ... 28
I-3 Modifications post-traductionnelles ... 30
I-4 Régulation par le PBD et localisation intracellulaire ... 31
I-5 Stabilité et dégradation de la protéine Plk1 ... 36
I-6 Les points de contrôle G2/M ... 37
II-Plk1 et la régulation du cycle cellulaire ... 38
II-1 L’entrée en mitose ... 39
II-2 La formation du fuseau mitotique ... 42
II-3 L’activation de l’APC/C... 44
II-4 La séparation des chromosomes... 45
II-5 La cytodiérèse ... 48
II-6 Le redémarrage du cycle après un arrêt G2/M ... 52
II-7 L’initiation de la réplication de l’ADN ... 53
PLK1 ET LE CANCER... 54
I-Plk1 et le cancer... 54
II- Stratégies thérapeutiques... 56
II-1 La micro-injection d’anticorps anti-Plk1 ... 56
II-2 Les approches antisens ... 56
II-3 Les inhibiteurs de Plk1 compétitifs de l'ATP... 57
II-4 Les inhibiteurs de Plk1 non compétitifs de l'ATP... 60
II-5 Les inhibiteurs de Plk1 et les autres membres de la famille des Plks ... 61
III-PLK1 ET LEUCEMIES AIGUËS MYELOÏDES... 62
III-1-L’hématopoïèse normale ... 62
III-1-1 Généralités ... 62
III-1-2 Les cellules hématopoïétiques ... 65
III-1-3 Les principaux acteurs du cycle cellulaire impliqués dans l’équilibre entre l’auto-renouvellement et la différenciation des CSH ... 66
III-1-4 Les voies de signalisations impliquées dans l’équilibre entre l’auto-renouvellement et la différenciation des CSH... 68
III-2 Les leucémies aiguës myéloïdes ... 69
III-2-1 Généralités ... 69
III-2-2 Classification FAB des LAM ... 71
III-2-3 Traitements et pronostics... 72
III-3 La leucémogenèse ... 73
III-3-1 Les cellules souches leucémiques... 73
III-3-2 La leucémogenèse... 74
III-4 Plk1 et les LAM ... 75
III-4-1 Les régulateurs du cycle cellulaire dans les LAM... 75
III-4-2 Statut de Plk1 dans les LAM ... 76
OBJECTIFS DU TRAVAIL... 77
RESULTATS ... 79
RESULTATS... 81
MATERIELS ET METHODES... 81
I- Vectorologie ... 81
II- Cultures cellulaires ... 83
II-1 Les modèles cellulaires ... 83
II-2 Construction des lignées inductibles ... 83
II-3 Entretien des lignées... 84
II-4 Transfections transitoires et traitements... 85
II-4-1 Blocage des cellules en mitose... 85
II-4-2 Transfection d’ADN plasmidique... 85
II-4-3 Transfection de siRNA ... 85
II-4-4 Induction de protéine ... 85
III- Analyse cytométrique du cycle cellulaire ... 86
IV- Analyse microscopique... 86
IV-1 Analyse de la morphologie des cellules... 86
IV-2 Analyse de la localisation de Plk1 ... 86
V- Analyses biochimiques ... 87
V-1 Analyse par immuno-empreinte... 87
V-1-1 Extraction protéique... 87
V-1-2 Electrophorèse et Western Blot ... 88
V-2 Analyse par la technologie Luminex ... 89
V-2-1 Extraction protéique... 89
V-2-2 Couplage des billes et des anticorps de capture... 90
V-2-3 Couplage des anticorps de détection et de la biotine ... 90
V-2-4 Test d’interaction Luminex et lecture... 90
CHAPITRE I-GENERATION D’OUTILS MOLECULAIRES ET CELLULAIRES : CONSTRUCTION DE LIGNEES INDUCTIBLES POUR PLK1... 92
I- Introduction ... 92
I-1 Justification de la génération des lignées inductibles ... 92
I-2 Principe de l’induction... 94
I-3 Présentation des différentes constructions... 94
II- Caractérisation des clones ... 95
II-1 Sélection des clones ... 95
II-2 Impact sur la prolifération ... 96
II-3 Effet dose de l’inducteur ... 99
II-4 Cinétique d’induction ... 99
II-6 Impact sur la morphologie des cellules ... 102
II-7 Impact sur la localisation de Plk1 ... 104
II-8 Analyse de quelques marqueurs d’activité de Plk1... 106
II-9 Analyse des effets d’un inhibiteur de Plk1 sur les clones inductibles... 109
III- Discussion ... 111
CHAPITRE II-MISE AU POINT DE TESTS CELLULAIRES PERMETTANT DE RENDRE COMPTE DE L’ACTIVITE D’INHIBITEURS DE LA POLO-LIKE KINASE 1 ... 115
I- Introduction à la technologie Luminex... 115
II- Mise au point des tests ... 116
II-1 Stratégie de mise au point des tests ... 116
II-2 Détection de la Plk1 ... 119
II-2-1 Mise au point de la détection de Plk1 ... 119
II-2-2 Dosage du niveau d’expression de la protéine Plk1 endogène ... 122
II-3 Détection de Emi1 ... 124
II-3-1 Mise au point de la détection de Emi1 ... 124
II-3-2 Dosage du niveau d’expression de la protéine Emi1 endogène... 125
II-3-3 Dosage du niveau d’expression de la protéine Emi1 suite à un traitement avec un inhibiteur de Plk1 ... 127
II-4 Détection de Wee1 ... 128
II-5 Détection de P-NPM ... 130
II-6 Détection de Aurora A ... 131
II-7 Optimisation des tests... 131
III- Discussion ... 133
CHAPITRE III-MISE AU POINT DE TESTS CELLULAIRES PERMETTANT DE RENDRE COMPTE DE L’ACTIVITE D’INHIBITEURS DU DOMAINE D’INTERACTION DE LA POLO-LIKE KINASE 1... 135
I- Introduction ... 135
II- Test de dimérisation de Plk1 par co-immunoprécipitation ... 135
II-1 Mise en évidence de la dimérisation de Plk1 ... 135
II-2 Analyse des domaines de Plk1 impliqués dans sa dimérisation... 136
III- Discussion ... 138
CHAPITRE IV-VALIDATION DE LA PLK1 EN TANT QUE CIBLE PHARMACOLOGIQUE DANS LE TRAITEMENT DES HEMOPATHIES MALIGNES DE TYPE LEUCEMIE AIGUËS MYELOÏDES... 139
I Introduction... 139
II- Article en révision ... 139
III- Résultats complémentaires... 174
IV- Discussion... 176
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ... 179
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES... 181
ANNEXES... 191
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES... 197
ABREVIATIONS
4EBP-1 : eukaryotic initiation factor (eIF)-4E-binding protein APC/C : anaphase-promoting complex/cyclosome
ARNm : acide ribonucléique messager ASOs : antisens oligonucléotides Asp : aspartate
ATM : ataxia telangiectasia mutated ATR : ATM- and Rad3-related
BFU-E : Burst Forming Unit-Erythroid BMP : Bone Morphogenic Proteins
CCT : chaperonin-containing TCP1 complex Cdc : cell division cycle
CDE : cell cycle-dependent element CDF-1 : CDE-CHR binding factor-1 Cdk : cyclin-dependent protein kinase CFU : Colony Forming Unit
CFU-E : CFU- érythrocytaires CFU-G : CFU- granulocytaires
CFU-GM : CFU- granulo-monocytaires CFU-L : Colony Forming Unit-Leukemia CFU-M : CFU-monocytaires
CFU-Meg : CFU-Megacaryocyte
CHFR : checkpoint with forkhead-associated and ring finger Chk1 : checkpoint kinase 1
CHR : cell cycle genes homology region CKI : Cdk kinase inhibitor
CLC : cellule souche leucémique CRS : cytoplasmic retention signal CSH : cellules souches hématopoïétiques D-box : destruction box
Ect2 : epithelial cell transforming 2 Emi1 : Early mitotic inhibitor 1 FGF : fibroblast growth factor
FKH-TFs : forkhead transcription factor Fnk : FGF-inducible kinase
Gln : glutamine
HAT : histone acetyltransferase
Hbo1 : human histone acetyltransferase binding to Orc1 HER2 : human epidermal growth factor
HIF-1a : hypoxia-inducible transcription factor-1a His : histidine
HRP : Horse radish peroxydase
HPP-CFU : High Proliferation Potential-CFU
HRPC : cancer de la prostate réfractaire aux hormones KD : Kinase Dead
kDa : kiloDalton KO : Knock-out
LAL : leucémie aiguë lymphoïde Leu : leucine
LMC : leucémie myéloïde chronique Luc : Luciférase
LTC-IC : Long Term Culture-Initiating Cell LT-HSC : Long Term Hematopoïetic stem cell Lys : lysine
M : mitose
Mcm : minichromosome maintenance complex Mdm2/Hdm2 : Murine/Human double minute 2 MEF : fibroblastes d’embryons murins
Met : méthionine
MPF : M phase-promoting factor
mTOR : mammalian target of rapamycin mTORC1 : mTOR Complex1
Myt1 : myelin transcription factor 1
MYPT1 : myosin phosphatase targeting subunit 1 NEBD : Nuclear Envelope Breakdown
NES : nuclear export signal NHL : non-Hodgkin’s lymphoma
NLS : nuclear localization signal NPM : B23/Nucléophosmine
NSCLC : cancers du poumon non à petites cellules OMS : Organisation Mondiale de la Santé
Orc : origin recognition complex
p70S6K : p70 ribosomal six protein kinase PARP : poly-ADP-ribose polymerase PB : Polo-box
PBD : Polo-box domain
PBIP1 : Polo-box interacting protein 1 PBS : phosphate-buffered saline Pc : Polo cap
P/CAF : p300/CBP-associated factor PCM : pericentriolar material
PDGF : platelet-derived growth factor
PDK1 : phosphoinositide-dependent protein kinase-1 PFA : parafomaldéhyde
PI3K : phosphatidylinositol 3-kinase PH : pleckstrin homology
PHLPP : PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase PICH : Plk1-interacting checkpoint helicase
PKA : protein kinase A PKB : protein kinase B PKC : protein kinase C
Plc : Polo-like kinase from Caenorhabditis elegans Plk : Polo-like kinase
Plx1 : Polo-like kinase of Xenopus laevis1 PP1C : protein phosphatase 1C
PP2A : protein phosphatase 2A PPIase : peptidyl-prolyl isomerase pRb : retinoblastoma protein
Prc1 : Protein regulator of cytokinesis 1 pre-RC : pre-replicative complex
Pro : proline
PTEN : phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10 RhoGEF : Rho guanine-nucleotide exchange factor
Rock2 : Rho-associated coiled–coil domain-containing protein kinase 2 ROS : Reactive Oxygen Species
rpS6 : ribosomal protein S6
SAR : structure-activity relationship SCF : Skp1-Cullin-F-Box-β-TRCP Ser : sérine
Sgo1 : Shugoshin 1 sSgo1 : short Sgo1
SHIP1 : SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase 1 SHIP2 : SH2 domain-containing inositol 5-phosphatase 2 siRNA : short interfering RNA
Slk : Ste20-like kinase Snk : serum-inducible kinase
SPAR : spine-associated Rap guanosine triphosphatase-activating protein S-PE : Streptavidine-Phycoérythrine
sSgo1 : short Sgo1
SVF : sérum de veau foetal
T-ALL : T-cell acute lymphoblastic leukemia TetO2 : opéron de résistance aux tétracyclines
TetR : répresseur de l’opéron de résistance aux tétracyclines Thr : thréonine
Trp : tryptophane
TSC1 : tuberous sclerosis 1 (Tuberin) TSC2 : tuberous sclerosis 2 (Hamartin) Tyr : tyrosine
UV : ultraviolet Val : valine
VEGF : vascular endothelial growth factor xPlkk1 : Xenopus Polo-like kinase kinase 1 3xF : 3xFlag
LISTE DES FIGURES, TABLEAUX ET ANNEXES
Page
Figure 1 : les différentes phases du cycle cellulaire. 14
Figure 2 : les différentes phases de la mitose. 15
Figure 3 : alignement des séquences protéiques de différents membres de la famille 20 Polo.
Figure 4 : régulation de l'expression de Plk1 au cours du cycle cellulaire et 24 comparaison avec le complexe cycline B/Cdk1.
Figure 5 : régulation transcriptionnelle de Plk1. 25
Figure 6 : structure schématique des différents domaines de Plk1. 26
Figure 7 : structure du domaine catalytique de Plk1. 28
Figure 8 : structure du domaine d’interaction protéine-protéine (PBD) de Plk1. 30
Figure 9 : modèle d’activation de Plk1 par Slk et par sa liaison avec un 33 phospho-peptide.
Figure 10 : localisation de Plk1 au cours de la mitose. Plk1. 35
Figure 11 : modèles de ciblage des substrats de la Plk1 par son PBD. 36
Figure 12 : l'interactome du PBD de Plk1. 37
Figure 13 : régulation de l’entrée en mitose par Plk1. 42
Figure 14: différents partenaires de Plk1 au cours des étapes finales de la mitose. 50
Figure 15 : modèle schématique de l’initiation de la cytodiérèse par Plk1. 51
Figure 16 : alignement des séquences des domaines catalytiques de Plk1, 2, 3 et 4. 63
Figure 17 : représentation schématique de l’hématopoïèse normale. 64
Figure 18 : principes de la division asymétrique et symétrique des cellules souches. 65
Figure 19 : représentation schématique de l’hématopoïèse normale et relation 72 avec les leucémies aiguës myéloïdes.
Figure 20 : principe de l’induction par addition de tétracycline. 94
Figure 21 : sélection des clones inductibles pour Plk1. 96
Figure 22 : analyse des effets de l’induction des différentes constructions Plk1 97 sur la prolifération cellulaire.
Figure 23 : analyse des effets de l’extinction de l’expression de Plk1 sur la 98 prolifération cellulaire.
Figure 24 : sélection des différents clones inductibles. 99
et la doxycycline, sur l’expression de Plk1.
Figure 26 : cinétique d’induction de Plk1. 100
Figure 27 : analyse des effets de l’induction des différentes constructions Plk1 sur 102 le cycle cellulaire.
Figure 28 : analyse des effets de l’induction des différentes constructions Plk1 sur la
morphologie des cellules. 103
Figure 29 : effet de la surexpression de Plk1 sur sa localisation sub-cellulaire. 105
Figure 30 : analyse des effets de l’induction ou de l’extinction de Plk1 sur ses 107 différents marqueurs d’activité.
Figure 31 : cinétique d’induction de la construction KD de Plk1. 108
Figure 32 : analyse des effets d’un inhibiteur de Plk1 sur l’activité de Plk1 dans des 110 cellules HeLa.
Figure 33 : analyse des effets d’un inhibiteur de Plk1 sur l’activité de Plk1 dans les 111 différents clones inductibles.
Figure 34 : principe du dosage de protéines par la technologie Luminex. 116
Figure 35 : stratégie de mise au point des tests. 117
Figure 36 : détection par la technologie Luminex de différentes formes de Plk1 120 surexprimées étiquetées 3xF.
Figure 37 : détection par la technologie Luminex de différentes formes de Plk1 121 surexprimées étiquetées 3xF.
Figure 38 : détection par la technologie Luminex de différentes formes de Plk1 122 surexprimées étiquetées HA.
Figure 39 : validation du dosage de la Plk1 endogène par la technologie Luminex. 123
Figure 40 : dosage par la technologie Luminex de Plk1 dans différentes lignées 124 cellulaires.
Figure 41 : par la technologie Luminex détection de Emi1 surexprimée étiquetée Flag. 125 Figure 42 : dosage par la technologie Luminex de Plk1 et de Emi1 dans différentes 126 lignées cellulaires.
Figure 43 : dosage par la technologie Luminex de Emi1 suite à l’extinction de Plk1. 126
Figure 44 : dosage par la technologie Luminex de Emi1 suite à l’inhibition de Plk1. 127
Figure 45 : dosage par la technologie Luminex de Plk1 et de Emi1 suite à 128 différents traitements.
Figure 46 : détection par la technologie Luminex de Wee1 étiquetée Flag et 129 surexprimée.
Figure 47 : dosage par la technologie Luminex de Wee1 suite à l’inhibition de Plk1. 129
Figure 48 : dosage par la technologie Luminex de P-NPM suite à l’inhibition de Plk1. 130 Figure 49 : détection par la technologie Luminex de Aurora A étiquetée HA et 131 surexprimée.
Figure 50 : test de couplage de l’anticorps de détection avec de la biotine. 132
Figure 51 : confirmation de la dimérisation de Plk1. 136
Figure 52 : co-immunoprécipitation de la Plk1 pleine taille étiquetée Flag avec 137 différents domaines de la Plk1 étiquetés HA.
Figure 53 : effets de la rapamycine sur la morphologie et le cycle des clones 175 inductibles pour la Plk1 suractivée.
Figure 54 : stratégie de détection de l’interaction protéine-protéine par la 186 technologie Luminex.
Tableau 1 : expression tissulaire et cellulaire de différents membres de la famille 21 Polo, ainsi que leurs fonctions.
Tableau 2 : tableau de tumeurs où Plk1 a été retrouvée surexprimée. 55
Tableau 3 : différents inhibiteurs de Plk1 compétitifs de l’ATP. 59
Tableau 4 : motifs consensus de phosphorylation des substrats de Plk1, 2, 3 et 4. 62
Tableau 5 : classification FAB des LAM. 73
Tableau 6 : différentes constructions de Plk1 et différents vecteurs utilisés. 82
Tableau 7 : composition des gels de polyacrylamide utilisé pour l’électrophorèse de 88 protéine.
Tableau 8 : anticorps utilisés dans notre étude. 89
Tableau 9 : contrôles réalisés lors de la mise au point des tests Luminex. 118
Annexe 1 :cartes des principaux vecteurs utilisés. 191
Annexe 2 :séquences des étiquettes utilisées. 192
Annexe 3 : stratégie de construction de shRNA (short hairpin RNA) spécifique 193 pour Plk1.
Annexe 4 : Evaluation of the level of Polo-like kinase in tumor cell extracts using 194 Luminex technology (Poster AACR 2005).
INTRODUCTION GENERALE
INTRODUCTION AUX POLO-LIKE KINASES
I- Le cycle de division cellulaire I-1 Généralités
Le cycle de division cellulaire est le procédé par lequel une cellule mère aboutit à deux cellules filles identiques. Il s’agit d’un processus très régulé qui permet la duplication des différents éléments de la cellule d’origine et leur distribution correcte entre les deux cellules filles.
La plupart des cellules de l’organisme ne se divisent pas. Elles sont en quiescence ou en phase G0 (Gap 0) du cycle cellulaire. Sous l’effet de différents facteurs, elles amorcent un cycle de division, composé de deux phases : l’interphase et la mitose (phase M) (figure 1). Au cours de l’interphase la cellule se prépare pour la division et duplique ses différents composants. Durant la mitose le matériel cellulaire se répartit entre les deux cellules filles.
Figure 1 : Les différentes phases du cycle cellulaires.
G0 (Gap 0) : les cellules ne se divisent pas, elles sont en quiescence. interphase :
- G1 : préparation de la cellule pour la phase S.
- S (Synthesis) : réplication de l’ADN, duplication du centrosome .
- G2 : préparation à la mitose, maturation des centrosomes et condensation des chromosomes. M (mitose) : division de la cellule mère en deux cellules filles identiques
L’interphase est constituée de trois phases. La phase G1 est une période de croissance de la cellule, qui contrôle l’état de son ADN et se prépare pour la phase S (synthesis). Au cours de la phase S, la cellule réplique et contrôle son ADN. Le centrosome (centre de
nucléation des microtubules) est également dupliqué au cours de cette phase. La phase G2 est une phase de contrôle et de préparation à la mitose, les centrosomes sont maturés et les chromosomes débutent leur condensation.
Figure 2 : Les différentes phases de la mitose.
Prophase : condensation des chromosomes ; migration des centrosomes aux pôles mitotiques ; rupture de
l’enveloppe nucléaire (Nuclear Envelope Breakdown ou NEBD). Prométaphase : formation du fuseau bipolaire mitotique ; capture et orientation des chromosomes. Métaphase : attachement bipolaire des chromosomes ; alignement des chromosomes au niveau de la plaque équatoriale ou métaphasique. Anaphase : séparation des chromatides sœurs. Télophase : migration des chromatides vers les pôles ; disparition du fuseau ; décondensation des chromosomes. Cytodiérèse : formation du fuseau médian à mi-chemin des pôles ; apparition d’une constriction marquant le site de la cytodiérèse ; constriction de l’anneau contractile aboutissant à la séparation physique des deux cellules filles.
La mitose est découpée en cinq étapes (figure 2). Durant la prophase les chromosomes achèvent leur condensation, les centrosomes se répartissent de part et d’autre du noyau, puis, l’enveloppe nucléaire est rompue (Nuclear Envelope Breakdown ou NEBD). Au cours de la prométaphase, le fuseau bipolaire mitotique se forme et capture les chromosomes qui commencent à s’orienter et à s’aligner. En métaphase, l’attachement bipolaire des chromosomes est achevé et entraîne leur alignement, formant la plaque équatoriale ou métaphasique. Pendant l’anaphase, les chromatides sœurs se séparent. Durant la télophase, les chromatides se dirigent vers les pôles, le fuseau disparaît, les chromosomes se décondensent. La télophase, la mitose et le cycle de division cellulaire s’achèvent par la cytodiérèse. Lors de
cette étape finale, une structure microtubulaire appelée fuseau médian se forme à mi-chemin des pôles et une constriction marque le site de la cytodiérèse. Puis, l’anneau contractile se resserre, les deux cellules filles ne sont plus reliées entre elles que par un pont cytoplasmique et une structure microtubulaire avant de finalement s’individualiser (Murray, 2004).
I-2 Les différents régulateurs du cycle cellulaire
Le cycle de division cellulaire est très régulé (Nurse, 2002). Chaque phase ne peut débuter que si la phase précédente s’est déroulée correctement. Des points de restriction ou "checkpoint", et différents mécanismes de contrôle interviennent tout au long du cycle cellulaire. Les catastrophes mitotiques de cellules de mammifères résultent d’une combinaison de déficiences au niveau des points de contrôle du cycle cellulaire (point de contrôle des dommages à l’ADN et point de contrôle de l’assemblage des fuseaux mitotiques) et de dommages cellulaires. L’échec de l’arrêt du cycle cellulaire avant ou pendant la mitose entraîne une mauvaise répartition des chromosomes entre les cellules filles, appelée aneuploïdie, qui peut amener à l’oncogenèse. La progression du cycle de division cellulaire est donc fortement régulée par différentes protéines.
Une famille de Sérine/Thréonine kinases, les Cdks (Cyclin-dependent kinases), orchestre la progression du cycle de division cellulaire et assure l’enchaînement des différentes phases du cycle par la phosphorylation de différents substrats au cours de ces phases (Cdk 1, 2, 3, 4, 6 et 7). L’activation des Cdks requiert leur association avec une sous-unité régulatrice appelée cycline (cyclines A à H et T). Au cours du cycle cellulaire, différents groupes de complexes peuvent être distingués : la cycline D associée aux Cdks 4 et 6 en phase G1, les cyclines E et A associées à la Cdk 2 pendant la phase S et les cyclines B et A associées à la Cdk1 durant la mitose (Murray, 2004). Le complexe cycline B/Cdk1 forme le MPF (M phase-promoting factor). Certaines Cdks sont impliquées dans des fonctions autres que la régulation du cycle cellulaire. Ainsi, Cdk7, 8 et 9 jouent un rôle dans la régulation de la transcription, et Cdk5 et 11 ont des fonctions dans les mécanismes de différenciation neuronale.
Les Cdks sont régulées par l’expression et la dégradation des cyclines, par des modifications post-traductionnelles telles que les phosphorylations ainsi que par l’expression et la dégradation de protéines inhibitrices, les CKI (Cdk kinase inhibitor).
Une seconde famille de Sérine/Thréonine kinases connue sous le nom de Polo-like kinases (Plk) a été identifiée comme étant fortement impliquée dans la progression du cycle cellulaire et de la mitose en particulier, ainsi que dans la maturation des centrosomes (Glover et al., 1998; Nigg, 1998). Chez les levures et les eucaryotes pluricellulaires, la kinase Polo n’est pas moins importante que les Cdks pour le cycle de division cellulaire. Sans Polo, les cellules échouent dans l’assemblage d’un fuseau mitotique bipolaire correct, et au contraire organisent leurs chromosomes mitotiques dans une formation circulaire autour d’un fuseau mono-polaire (Sunkel and Glover, 1988).
II-La famille des Polo-like kinases
II-1 La découverte de la protéine Polo chez la Drosophile
La protéine kinase Polo et les Polo-like kinases forment une famille très conservée de régulateurs de multiples évènements au cours du cycle de division cellulaire. Le membre fondateur de cette famille, Polo, a été originellement identifié chez Drosophila melanogaster, et s’est avéré être une Sérine-Thréonine kinase nécessaire à la mitose (Sunkel and Glover, 1988). Des mutations dans le gène codant pour Polo résultent dans des divisions mitotiques et méiotiques anormales. Deux mutations ont été décrites comme étant impliquées dans la diploïdie de larve de drosophile, polo1 et polo2. L’allèle polo2 est létal pour les larves, tandis que l’allèle polo1 est semi-létal : 7% des embryons homozygotes éclosent. Les larves homozygotes pour polo1 présentent des divisions mitotiques aberrantes au niveau des cellules du cerveau et des méioses anormales ont été observées chez les mâles homozygotes qui sont stériles. Les embryons des femelles polo1 homozygotes ont des fuseaux mitotiques anormaux, multi-branchés, des pôles mitotiques défectueux et leur développement s’arrête rapidement (Sunkel and Glover, 1988).
Le gène polo a été cloné en 1991 (Llamazares et al., 1991) et deux transcrits ont été trouvés (2,2 et 2,5 kb). Le locus de ce gène est localisé sur le chromosome 3. Le gène polo code pour une protéine de 577 acides aminés dans laquelle la séquence de 277 acides aminés du domaine N-terminal présente une identité importante avec le domaine catalytique des protéines kinases et contient les 11 sous-domaines conservés de ces protéines (Hanks et al., 1988). La séquence GTANYIAPE, typique des protéines Sérine/Thréonine kinases, a été retrouvée dans la protéine Polo (Llamazares et al., 1991). La protéine Polo possède également
deux séquences particulières dans son domaine C-terminal, les boîtes Polo (Polo-box, PB1 et PB2). Ce domaine C-terminal est donc appelé domaine Polo-box (Polo-box domain ou PBD). Ce domaine Polo-box définit la famille des Polo-like kinases. Il est retrouvé chez tous les membres de cette famille, avec toutefois quelques variations dans le nombre et la taille des boîtes Polo.
II-2 Exemples de protéines de la famille Polo, très conservée au cours de l’évolution
Par la suite, la protéine Polo a été retrouvée dans des espèces diverses, allant des eucaryotes unicellulaires aux eucaryotes supérieurs. Ainsi, des protéines homologues de Polo ont été retrouvées chez les protozoaires (T. Brucei…), chez les levures (S. cerevisiae, S.
pombe, K. lactis…), chez les invertébrés et les insectes (C. elegans, D. melanogaster, A. mellifera…), chez les poissons et les organismes marins (D. rerio, C. intestinalis…), chez des
oiseaux (G. galus…), chez les amphibiens (X. laevi…), chez les mammifères (M. musculus,
C. lupus, H. sapiens…)... Ces organismes possèdent une ou plusieurs protéines homologues
de Polo avec des rôles variés au cours du cycle cellulaire.
Le gène cdc5, codant pour l’homologue de la protéine Polo chez Saccharomyces
cerevisiae a été découvert par complémentation fonctionnelle dans une souche de levure
portant une mutation thermosensible pour le gène DBF4/Cdc7 (Kitada et al., 1993). Cdc5 possède une forte homologie de séquence avec la protéine Polo de Drosophila melanogaster, en particulier au niveau des Polo Box. Elle a donc été intégrée à la famille Polo. Des levures mutantes pour Cdc5 présentent une morphologie en forme d’haltère avec des noyaux divisés mais toujours liés. La délétion de Cdc5 est létale.
Le gène codant pour la protéine Plo1, isolé chez Schizosaccharomyces pombe, présente une forte homologie de séquence avec les protéines de la famille Polo (Ohkura et al., 1995). Son rôle est essentiel pour la progression de la mitose chez S. pombe. L’un des principaux phénotypes cellulaires résultant d’une perte du gène plo1 est l’échec des pôles mitotiques à former des fuseaux mitotiques bipolaires. L’autre phénotype cellulaire majeur est l’échec de la formation de l’anneau contractile.
Trois protéines homologues de Polo ont été identifiées chez Caenorhabditis elegans suite à son séquençage, Plc1, Plc2 et Plc3 (Polo-like kinase from Caenorhabditis elegans 1,2
et 3) (Ouyang et al., 1999; Chase et al., 2000a). Plc2 ne possède pas de Polo-Box complète. Les gènes plc1 et plc2 proviennent certainement d’une duplication d’un gène ancestral, suivie d’une évolution indépendante (Ouyang et al., 1999). Des embryons de Caenorhabditis
elegans Plc1-/- ne peuvent pas se diviser ni achever la méiose, suite à de nombreuses anomalies au cours de la rupture de l’enveloppe nucléaire, de la ségrégation des chromosomes et de la cytodiérèse (Chase et al., 2000a; Chase et al., 2000b).
Plx1, une protéine kinase présentant une forte homologie de séquence avec les protéines de la famille Polo a été isolée à partir d’œufs de Xenopus laevis (Kumagai and Dunphy, 1996). La Plx1 phosphoryle Cdc25c, une phosphatase qui active le MPF, jouant donc un rôle dans la progression de la mitose (Kumagai and Dunphy, 1996; Abrieu et al., 1998). Par ailleurs, l’addition de Plx1 catalytiquement inactive tout comme la déplétion de Plx1 bloquent la transition mitose/interphase d’œufs de Xénope (Descombes and Nigg, 1998), suite à l’arrêt de la machinerie de protéolyse qui contrôle la sortie de mitose. Par la suite, deux autres protéines de la famille Polo ont été clonées chez le Xénope : Plx2 et Plx3 (Duncan et al., 2001). Les trois membres de la famille Polo découverts chez le Xénope sont présents dans les oocytes et les œufs fécondés mais le profil d’expression de ces protéines varie au cours de l’embryogenèse. Elles possèdent des mécanismes de régulation et peut-être des substrats communs dans les oocytes mais des fonctions en partie distinctes au cours des dernières étapes du développement.
L’homologue murin du gène Polo, plk, a été cloné en 1993 (Clay et al., 1993) et la séquence du gène humain, plk1, a été clonée indépendamment par différentes équipes à la même époque (Lake and Jelinek, 1993; Hamanaka et al., 1994; Holtrich et al., 1994). Par la suite, trois autres kinases ont été intégrées à la famille Polo chez les mammifères, Plk2, Plk3 et Plk4, découvertes chez la Souris (Simmons et al., 1992; Fode et al., 1994; Donohue et al., 1995).
Une analyse des séquences des différents membres de la famille des Polo-like kinases montre des pourcentages d’homologie qui varient de 23% entre la Plc1 et Cdc5, et proches de 95% entre les Plk1 humaine et murine. De plus, un alignement de quelques unes de ces protéines permet d’observer des séquences communes, caractéristiques des Sérine/Thréonine kinases et plus spécifiquement des Polo-like kinases (figure 3).
Figure 3 : Alignement des séquences protéiques de différents membres de la famille Polo. Le domaine
kinase (I à XI) et les deux boîtes polo sont soulignés. Les trois résidus Trp 414, His 538 et Lys 540, très conservés au cours de l’évolution, sont indiqués par une étoile.
II-3 Les Polo-like kinases des mammifères
Les données issues des études actuelles indiquent quelques divergences parmi les membres de la famille Plk exprimés chez les mammifères, au niveau de leur expression spatio-temporelle, de leur localisation subcellulaire, de leur régulation, de leur spécificité de substrat et de leurs fonctions biologiques, parfois chevauchantes mais jamais redondantes (tableau 1).
Tableau 1 : Expression tissulaire et cellulaire de différents membres de la famille Polo, ainsi que leurs fonctions. Les quatre Plks observées chez les mammifères ont une expression tissulaire spécifique. Leurs
niveaux d’expression varient en fonction du cycle cellulaire. Ainsi, Plk1, 2 et 4 ont une demi-vie intracellulaire relativement courte alors que l’expression de Plk3 est stable tout au long du cycle cellulaire (Myer et al., 2005; Lake et Jelinek, 1993; Holtrich et al., 1998, Chase et al., 1998; Ouyang et al., 1997;Fode et al., 1996; Tategu et al., 2008). Elles sont plus ou moins indispensables aux processus cellulaires qu’elles régulent, et leur délétion chez la souris ont de fortes répercussion sur la vie de l’animal, allant jusqu’à la létalité au stade embryonnaire selon les cas.
Des quatre kinases exprimées chez les mammifères, Plk1 est la mieux caractérisée et possède le plus haut degré d’homologie avec la Plk unique des organismes inférieurs. Les souris Plk1-/- sont abortives au stade 8 cellules ce qui fait du gène codant pour Plk1 un gène essentiel à la vie de l’organisme. Elle conduit la plupart des fonctions des Plks durant la mitose et la cytodiérèse, tandis que les autres Plks de mammifères sont plus spécialisées, avec des rôles moins bien caractérisés jusqu’à présent.
Plk2, également appelée Snk (Serum-inducible kinase) car son expression est fortement induite par l’addition de sérum, a été identifiée comme le produit d’un gène de croissance de réponse précoce, dont l’expression est induite rapidement après l’addition d’un agent mitogène (Simmons et al., 1992).
La fonction principale de Plk2 est probablement celle de régulateur de la progression de la phase G1 et du début de la phase S (Simmons et al., 1992; Ma et al., 2003b). Plk2 est également un régulateur de la dynamique de l’actine et de la morphologie de la crête des dendrites. Elle est retrouvée activée dans des neurones post-mitotiques où elle phosphoryle la protéine SPAR ce qui entraîne sa dégradation et la perte de la crête des dendrites matures (Kauselmann et al., 1999; Pak and Sheng, 2003; Seeburg et al., 2008). Plk2 est également
impliquée dans la duplication des centrioles au cours de la phase S (Warnke et al., 2004) ainsi que dans la progression du cycle cellulaire (Ma et al., 2003a). Plk2 joue également un rôle dans divers points de contrôle du cycle de division cellulaire, tels que le point de contrôle des dommages du fuseau mitotique (Burns et al., 2003), ou encore le point de contrôle des dommages à l’ADN, où ses fonctions semblent s’opposer à celles de Plk1 (Shimizu-Yoshida et al., 2001). Dans ce contexte, il est intéressant de noter que Plk2 a été décrite comme le produit d’un gène suppresseur de tumeur dans des cellules B néoplasiques (Smith et al., 2006). Cependant, Plk2 n’est pas un gène essentiel. En effet, des embryons de souris Plk2-/- sont viables, bien que leur croissance et le développement de leur squelette soient retardés (Ma et al., 2003a). Il reste cependant à déterminer si les autres membres de la famille des Plks peuvent compenser la perte de Plk2 et de ces fonctions.
Plk3, également appelée Fnk (fibroblast growth factor-inducible kinase) ou Prk (proliferation related kinase), est certainement la Plk la plus étudiée après Plk1 chez les mammifères. Elle a été identifiée comme un gène de réponse précoce et tout comme Plk2, son niveau d’ARNm s’élève rapidement après l’addition de molécules mitogènes (Donohue et al., 1995). Elle est phosphorylée au cours de la mitose ce qui entraîne une augmentation de son activité (Chase et al., 1998), puis elle est déphosphorylée lors d’une étape tardive de la mitose. Elle est régulée en réponse à des stimulations par des facteurs de croissance et le stress (Eckerdt et al., 2005; Winkles and Alberts, 2005; Xie et al., 2005).
Généralement, les fonctions de Plk3 et de Plk1 semblent s’opposer. Ainsi, la surexpression de la Plk1 murine entraîne la transformation oncogénique, tandis que la surexpression de la Plk3 humaine inhibe la croissance cellulaire en induisant l’apoptose (Conn et al., 2000). Cependant, Plk3 comme Plk1 complémente les mutants de Cdc5 sensibles à la température dans la levure bourgeonnante (Lee and Erikson, 1997; Ouyang et al., 1997), ce qui indique un certain chevauchement de leurs fonctions et probablement des rôles qui se sont différenciés au cours de l’évolution. Plk3 détiendrait plusieurs rôles dans le cadre de réponses aux dommages à l’ADN, opposés à ceux de Plk1, en particulier lors de l’activation des voies ATM/ATR (Xie et al., 2001) ainsi que de Chk1 et 2 (Wang et al., 2002) et dans le cas de la régulations de deux substrats communs avec Plk1, p53 (Hirao et al., 2000; Shieh et al., 2000) et Cdc25c (Ouyang et al., 1999; Bahassi el et al., 2004). Enfin, Plk3 phosphoryle la polymérase de l’ADN δ, ce qui suggère son implication probable dans la réparation des dommages à l’ADN (Xie et al., 2005).
Il a également été décrit que Plk3 est nécessaire pour l’expression de la cycline E et l’entrée en phase S (Zimmerman and Erikson, 2007). Elle permet aussi la progression de la mitose (Xie et al., 2001; Bahassi el et al., 2004; Myer et al., 2005) et elle phosphoryle Cdc25a (Kang et al., 2008) et Cdc25b (Ouyang et al., 1999). Plk3 participe à la dissociation de l’appareil de Golgi (Ruan et al., 2004). Elle régule la dynamique des microtubules, exerce des fonctions centrosomiales (Wang et al., 2002) et joue également un rôle dans l’adhésion cellulaire (Holtrich et al., 2000). Elle est constitutivement exprimée dans les neurones post-mitotiques et est certainement impliquée dans la plasticité synaptique (Kauselmann et al., 1999). Comme Plk2, elle phosphoryle SPAR, conduisant à sa dégradation et à la perte des crêtes des dendrites matures.
Comme Plk2, Plk3 n’est pas un gène essentiel. Des souris Plk3-/- âgées ont une augmentation de poids et développent des tumeurs dans plusieurs organes (Yang et al., 2008). Le rôle de suppresseur de tumeur de Plk3 passe en partie par la régulation de la voie de signalisation de HIF-1 (hypoxia-inducible factor-1). Plk3 régule négativement HIF-1 en conditions d’hypoxie. Le rôle de suppresseur de tumeur de Plk3 fait sans doute intervenir d’autres substrats impliqués dans la réparation des instabilités génétiques, encore à déterminer.
Plk4/Sak/Stk18 est le dernier membre de la famille des Plks humaines à avoir été identifié. Elle ne possède qu’une boîte polo. Son expression, spécifique des tissus et de l’âge, est corrélée à une forte activité mitotique et méiotique dans les tissus embryonnaires comme dans les tissus adultes (Fode et al., 1994). La régulation de l’activité de Plk4 reste inconnue à l’heure actuelle.
Comme Plk1, Plk4 est nécessaire pour la viabilité des cellules (Fode et al., 1994; Li et al., 2005). L’embryogenèse de souris Plk4-/- s’arrête après la gastrulation avec une augmentation de l’index mitotique et de l’apoptose des cellules. Plk4 régule la dégradation de la cycline B dépendante de l’APC/C (Macmillan et al., 2001). Cdc25c est un substrat de Plk4 et l’extinction de l’expression de cette dernière inhibe la prolifération cellulaire (Bonni et al., 2008). Plk4 intervient dans la duplication des centrioles, ce qui pourrait expliquer son rôle crucial dans la prolifération cellulaire (Fode et al., 1994; Bettencourt-Dias et al., 2005; Habedanck et al., 2005; Li et al., 2005). Plk4 recrute Sas6 et Sas5, deux protéines nécessaires à l’assemblage et à l’élongation du précurseur cylindrique du centriole (Rodrigues-Martins et al., 2008). Plk4 est également impliquée dans l’endocycle. Elle phosphoryle et active Hand1,
une protéine essentielle pour la formation du placenta et la morphogenèse du cœur (Martindill and Riley, 2008).
LA POLO-LIKE KINASE 1
I- Structure et régulation de la Plk1
I-1 Régulation transcriptionnelle du gène de la Plk1
Le niveau d’expression des ARNm et le niveau protéique de Plk1 sont faibles durant la phase G1, augmentent au cours de la phase S et atteignent leur maximum pendant les phases G2/M pour revenir à un niveau basal à la fin de la mitose (Smith et al., 1997; Uchiumi et al., 1997). Le profil d’expression du complexe Cdc2/Cycline B est similaire à celui de Plk1 (figure 4).
Figure 4 : Régulation de l'expression de Plk1 au cours du cycle cellulaire et comparaison avec le complexe cycline B/Cdk1. (courbes schématiques d'après Golsteyn et al., 1994 ; Lee et al., 1995 ; Uchiumi et al., 1997).
Dans les cellules mammifères en culture, le niveau d’expression protéique de Plk1 est très bas en G1. Il augmente progressivement pendant les phases G2 et M, puis décroît après la mitose. La cinétique d’expression de Plk1 est similaire à celle du complexe Cdk1-cycline B.
Le gène de la Polo-like kinase humaine est situé sur le bras p du chromosome 16, entre les points 11.2 et 13.1. Ce gène présent en un exemplaire est composé de 11.488 bases contenant 12 exons (Ensembl). Son ARNm de 2,3kb code pour un polypeptide de 603 acides aminés avec une masse moléculaire de 68kDa.
L’expression du gène de Plk1 ne semble pas régulée par la stabilité de ses ARNm, mais plutôt à un niveau transcriptionnel. Différents éléments régulateurs ont été localisés au niveau du promoteur de Plk1 (-93 à +63) (Uchiumi et al., 1997) : des régions de type répresseurs CDE (cell cycle-dependent element) et CHR (cycle genes homology region ) en position -8 à +14 ; et des régions d’activation dont une séquence de fixation de E2F en
position -131 à -122, deux séquences riches en GC appelées SP1 en position -93 à -75 et -65 à -35, et une boîte CCAAT en position -45 à -33 (figure 5).
Figure 5 : Régulation transcriptionnelle de Plk1. A : schéma des différents éléments liés à l’ADN et facteurs
de transcription impliqués dans la répression dépendante du cycle du promoteur de Plk1 (phase G1). Le site d’initiation de la transcription est indiqué comme +1. L’élément répresseur CDE/CHR peut être lié par CDF-1 ou un autre répresseur transcriptionnel non identifié qui bloque activement l’expression de l’ARNm de Plk1 durant la phase G1. Cette inhibition est régie par des interférences du répresseur avec l’interaction des transactivateurs sur les sites de fixation proches (boîtes CCAAT et séquences riches en GC), et peut être induite par p53 et p21. De plus, le promoteur de Plk1 est réprimé par le complexe de E2F4 et des protéines p107 et p130, membres de la famille pRB. B : schéma des différents éléments liés à l’ADN et facteurs de transcription impliqués dans l’activation dépendante du cycle du promoteur de Plk1 (G2/M). L’élément répresseur CDE/CHR semble inoccupé quand les cellules entrent en G2/M, permettant aux transactivateurs d’induire l’expression de l’ARNm de Plk1 via leurs sites de liaison à l’ADN. De plus, les FKH-TF sont associés avec au moins un site de liaison présent dans le promoteur de Plk1 entre les bases -728 et -325 (D'après Martin et al., 2006).
La régulation négative de la transcription de Plk1 survient lors d’une interaction entre la protéine p21Waf1/Cip1/Sdi1 et une protéine, peut-être CDF-1 (CDE-CHR binding factor-1), se fixant sur les séquences CDE et CHR (Zhu et al., 2002). p53, un régulateur de p21, réprime également l’expression de l’ARNm de Plk1 (Martin and Strebhardt, 2006).
Les facteurs de transcription de la famille E2F régulent également la transcription de Plk1. Ainsi, E2F4 s’associe avec les protéines p107 et p130 de la famille pRB pour inhiber la transcription de Plk1 (Gunawardena et al., 2004), tandis que E2F1 et E2F2 sont des régulateurs positifs du promoteur de Plk1 (Tategu et al., 2008).
Les FKH-TFs (forkhead transcription factors) font partie d’une autre famille de facteurs de transcriptions impliqués dans la régulation positive de l’expression du gène de Plk1 au cours de la transition G2/M (Alvarez et al., 2001). Ainsi, un site consensus de liaison de FOXO3
(FKHRL1), un membre de la famille FKH-TF, est retrouvé dans le promoteur de Plk1. De même, FOXO1 est retrouvée sur le promoteur de Plk1 au cours de la transition G2/M (Yuan et al., 2008).
L’expression de Plk1 est donc fortement régulée au niveau de sa transcription par l’intermédiaire de multiples facteurs de transcriptions activateurs et répresseurs. Pourtant, elle est retrouvée fortement exprimée dans de nombreux cancers. On peut se demander si cette surexpression de Plk1 et l’activation inappropriée qui en découle sont à l’origine du processus d’oncogenèse, ou bien une de ses conséquences ?
I-2 Les différents domaines de la Plk1
La Plk1 est composée d’un domaine catalytique en N-terminal, porteur de l’activité Sérine/Thréonine kinase, et d’un domaine d’interaction protéine-protéine en C-terminal (figure 6). Ces deux domaines sont raccordés via un lien contenant un motif de destruction (D-box) qui permet la dégradation de Plk1 en fin de mitose (Lindon and Pines, 2004). La localisation de cette D-box n’est pas toujours conservée chez les différents eucaryotes. Ainsi, chez Saccharomyces cerevisiae, elle est située dans le domaine N-terminal.
Figure 6 : Structure schématique des différents domaines de Plk1. Le domaine catalytique de Plk1 est
indiqué en rouge et ses sous-domaines par des chiffres romains. Les deux Polo-box sont indiquées en orange. La D-Box est indiquée en vert, la région Polo-Cap en bleu, les résidus importants pour la régulation et l’activité de la kinase sont indiqués en italiques.
I-2-1 Le domaine kinase
Le domaine catalytique de Plk1 permet la phosphorylation de résidus Sérine et Thréonine. Une analyse des séquences de substrats de Plk1, suivie de l’optimisation d’un peptide pouvant servir de substrat à Plk1 a permis de définir une séquence consensus
phosphorylée par Plk1 (D/E-X-S/T-
Ψ
-X-D/E,Ψ
est un acide aminé hydrophobe) (Nakajima et al., 2003).Le domaine catalytique de Plk1 présente tous les motifs caractéristiques des Sérine/Thréonine kinases (Hanks et al., 1988), en particulier au niveau du sous-domaine VI (résidus HRDLKLG), et du sous-domaine VII (résidus GTPNYIVPE) (Clay et al., 1993; Golsteyn et al., 1994). Ce dernier, situé entre le globe N-terminal et le globe C-terminal du domaine kinase est fortement conservé et appelé boucle d’activation (T-loop). Il est retrouvé chez de nombreuses kinases (PKA, Cdk1/2, Aurora A/B…) et permet leur activation suite à la phosphorylation d’un résidu très conservé (Thr210, chez Plk1) (Johnson et al., 1996). Les résidus essentiels à la structure des protéines kinases sont conservés dans ce domaine catalytique, qui possède également des motifs caractéristiques et spécifiques de la famille des Polo-like kinases. Ainsi, la région permettant la fixation de l’ATP (poche ATP) possède un motif GxxGGxAxC (résidus 60 à 67), à la place de la séquence consensus CxGxxGxV retrouvée chez les autres kinases. Un autre résidu, la Sérine 137 (Ser137), joue quant à elle un rôle important dans la sélectivité des substrats, de fait de sa position dans le site de liaison de ces derniers (Jang et al., 2002).
Le domaine catalytique de Plk1 a été cristallographié récemment (Lowery et al., 2005; Kothe et al., 2007a). Suite à la difficulté de cristallisation de la forme sauvage du domaine kinase de Plk1, les auteurs se sont servis d’une forme mutante de Plk1, (T210V), à l’activité plus faible. La cristallisation a été réalisée en présence d’un analogue non hydrolysable de l’ATP (AMPPNP), afin de placer le domaine kinase dans une conformation active. L’analyse de la structure de ce cristal a permis de confirmer que le domaine kinase de Plk1 a une conformation fortement semblable à celle d’autres kinases dans leur état actif (PKA notamment) (figure 7A), ainsi que le suggérait un modèle proposé dans une publication antérieure (Lowery et al., 2005).
Le site de liaison de l’ATP est situé dans une poche formée entre le globe N-terminal (résidus 37 à 131) et le globe C-terminal (résidus 138 à 330). Le globe N-terminal est composé principalement de feuillets β anti-parallèles, et le globe C-terminal, d’hélices α. Les deux globes sont connectés par une région charnière sur laquelle repose les interactions avec les substrats liés. Les résidus 306 à 330 font partie du lien raccordant les domaines kinase et PBD de Plk1.
Figure 7 : Structure du domaine kinase de Plk1. A : Vue générale de la structure cristallisée du domaine
kinase de Plk1. Plk1 est indiquée par un ruban gris, avec les extensions N et C-terminales en orange par rapport au noyau du domaine kinase et la boucle d’activation est en vert. Les résidus Val210 de la boucle d’activation (Thr210 : premier site de phosphorylation dans la Plk1 sauvage) et S137 (probablement le second site de phosphorylation) sont indiqué en vert. B : Superposition du peptide substrat de PKA sur la structure de Plk1, avec des résidus sélectionnés. Les résidus sont indiqués par un code couleur. C : Mode d’interaction de la molécule d’AMPPNP avec la poche ATP de Plk1. Les deux conformations possibles du groupe phosphate sont représentées. Les ions magnésium présents dans le tampon de cristallisation sont indiqués par des sphères bleues claires. Les atomes des chaînes principales sont omis, à l’exception des résidus de la région charnière. Les chaînes latérales ne sont pas représentées pour les résidus indiqués entre parenthèses (d'après Kothe et al., 2007).
Le segment d’activation (résidus 194 à 221) est une boucle à la localisation centrale qui contribue dans une forte proportion au site de fixation du substrat (Lowery et al., 2007). Le résidu Thr210 est situé dans cette boucle d’activation. Sa phosphorylation stabilise la boucle d’activation dans une conformation ouverte et étendue qui permet la fixation du substrat. Des interactions de la phospho-thréonine avec un groupe adjacent contenant des chaînes latérales chargées positivement et un squelette d’azote jouent probablement un rôle dans l’alignement des globes N et C-terminaux du domaine kinase dans une conformation catalytiquement compétente ou dans l’orientation correcte et le positionnement de résidus catalytiques clefs (Johnson et al., 1996).
La Sérine 137 partage un contexte similaire à celui de la Thréonine 210. Elle a été proposée comme second site de phosphorylation de Plk1 (Jang et al., 2002). Une mutation de ce résidu en Aspartate augmente très fortement l’activité de la kinase. Le résidu Ser137 est
situé dans une poche entre la région charnière et l’hélice α D (figure 7A et B) (Kothe et al., 2007a). Elle est donc difficilement accessible pour une phosphorylation par des kinases sans changement conformationnel significatif et/ou des mouvements des deux globes de Plk1. Lors de l’interaction de Plk1 avec ses substrats, ce résidu se positionne près de la position Ser/Thr-3 du substrat. Sa phosphorylation introduirait une forte charge négative et augmenterait la sélectivité de résidus chargés positivement, tels qu’une Arginine ou une Lysine, en position -3 du substrat. La phosphorylation du résidu Ser137 pourrait donc moduler la spécificité de Plk1, et conduire à la phosphorylation de cibles alternatives de Plk1 (Lowery et al., 2005). Le résidu correspondant chez PKA est un Glutamate, qui interagit bien avec une Arginine située en P-3 dans la structure cristalline de PKA (figure 7B).
La molécule d’AMPPNP est liée par différents nucléotides dans la poche ATP en accord avec la liaison observée pour d’autres kinases (Kothe et al., 2007a). La portion Adénine est orientée dans le site de liaison (figure 7C). Néanmoins, certains résidus situés dans cette poche différencient nettement Plk1 des autres kinases : le résidu Phe183, qui crée un encombrement au fond du site de liaison ; le résidu Cys67 plus petit sur le plafond de la poche ; le résidu Leu132 qui crée une poche dans la région charnière, et un groupe de résidus chargés positivement dans la région exposée au solvant à l’extérieur de la poche Adénine. L’originalité des caractères structuraux du site de fixation de l’ATP de Plk1 présente un atout majeur dans le cadre de la recherche d’inhibiteurs spécifiques de Plk1.
I-2-2 Le domaine Polo Box
Le domaine d’interaction protéine-protéine, également appelé domaine Polo-box (PBD), est un domaine de liaison de Plk1 sur des résidus phospho-Sérine/Thréonine (résidus 367 à 603) (Elia et al., 2003a). Il est constitué de deux boîtes Polo, PB1 (résidus 411 à 492) et PB2 (résidus 511 à 592) et d’une extension N-terminal (résidus 372 à 410), appelée Polo-cap, qui se replie sur PB2 et stabilise la structure (figure 8A) (Cheng et al., 2003; Elia et al., 2003b; Stier et al., 2003). L’analyse d’une banque de peptides a permis de déterminer le motif phospho-peptidique idéal reconnu par le PBD de Plk1 : Pro-Met-Gln-Ser-[phospho-Thr]-Pro-Leu. La cristallographie du domaine Polo-box de Plk1 a été réalisée en présence de ce phospho-peptide.
Figure 8 : Structure du domaine d’interaction protéine-protéine (PBD) de Plk1. A : Vue générale de la
structure cristallisée du domaine Polo-Box de Plk1. Plk1 est représentée par un ruban. Le phosphopeptide d’interaction optimal (Pro-Met-Gln-Ser-[phospho-Thr]-Pro-Leu) est indiqué en bâtonnets, avec ses carbones en jaune et le groupement phosphate en sphères transparentes. Les deux Polo-Box (PB1 et PB2) sont colorées en rouge et en bleu, tandis que la région Polo cap est colorée en vert. (Lowery et al., 2005). B : Superposition de PB1(noir) à PB2 (gris). C : Alignement des séquences de PB1 et de PB2 en fonction de leur structure. Les résidus équivalents structurellement sont indiqués en gras. Les résidus en contact avec le phospho-peptide sont indiqués par un astérisque. (Cheng et al., 2003). D : Interactions entre le phosphopeptide et le PBD de Plk1 (le premier résidu Proline n’est pas indiqué sur ce schéma). Le phosphopeptide est coloré en rouge et Plk1 en bleu. Les liaisons hydrogène sont indiquées en pointillés (Cheng et al., 2003).
Chacune des Polo-box présente un repliement identique basé sur six feuillets β antiparallèles et une hélice α (figure 8B et C), bien que leur séquence primaire ne soit identique qu’à 12%. Les boîtes Polo forment les deux moitiés symétriques d’un sillon dans lequel le phospho-peptide est pris en tenaille (figure 8A) (Elia et al., 2003a; Stier et al., 2003). Ce sillon est situé entre deux feuillets β et contient la région la plus conservée du PBD, impliquée dans la reconnaissance des partenaires de Plk1, notamment les résidus Tryptophane 414 (Trp414), Histidine 538 (His538) et Lysine 540 (Lys540). Ils formeraient une "pince" permettant d’accrocher un motif phosphorylé caractéristique des partenaires de Plk1 (Elia et al., 2003b). Le groupe phosphate est lié par huit interactions hydrogène mettant en jeu des contacts indirects à l’aide de molécules d’eau ordonnées et des contacts directs avec les chaînes latérales des résidus His538 et Lys540 (figure 8D). La mutation de ces deux résidus en Alanine inhibe l’interaction de Plk1 avec ses partenaires, ce qui confirme leur importance dans le fonctionnement du PBD de Plk1 (Elia et al., 2003b). La forte sélection pour un résidu
Sérine en position pThr-1 est due à trois liens hydrogène entre la chaîne latérale de la Sérine-1 et les atomes de la chaîne principale du résidu Trp414, ainsi qu’une liaison avec le squelette carboné du résidu Leu491, par l’intermédiaire d’une molécule d’eau. Le résidu Proline en position p-Thr/p-Ser+1 ajoute une petite contribution à la surface de contact et limite l’effet entropique.
I-3 Modifications post-traductionnelles
L’activation de Plk1 nécessite une phosphorylation, et ce de façon dépendante du cycle cellulaire. En effet, l’activité de Plk1 suit le même profil que sa phosphorylation : elles augmentent lors de la transition G2/M (Hamanaka et al., 1995).
Plk1, comme beaucoup d’autres kinases, possède un résidu thréonine (Thr210) dans sa boucle d’activation. La cartographie par phospho-peptide a proposé ce résidu comme site majeur de phosphorylation de Plk1 par xPlkk1 (Xenopus Polo-like kinase kinase 1) (Jang et al., 2002). Ainsi, la Thr210 est phosphorylée in vivo, ce qui entraîne un changement de conformation du segment d’activation. Une mutation phospho-mimétique Thr210Asp active Plk1, tandis qu’une mutation Thr210Val réduit son activité (Jang et al., 2002).
Slk (Ste20-like kinase), l’homologue humain de xPlkk1, phosphoryle et active Plk1 in
vitro et stimule son activité in vivo (Ellinger-Ziegelbauer et al., 2000; Johnson et al., 2008),
mais il n’a pas été clairement démontré in vivo que cette kinase est l’activateur en amont de Plk1. Une deuxième kinase humaine, Stk10, coopérerait avec Slk pour phosphoryler Plk1 (Walter et al., 2003). Plusieurs études récentes proposent la protéine Aurora A, avec l’aide de son co-facteur Bora, comme kinase initiatrice de l’activation de Plk1 au cours de la phase G2 (Macurek et al., 2008; Seki et al., 2008b). Ainsi, Bora s’accumule au cours de la phase G2, interagit alors avec le PBD de Plk1, permet l’interaction de Plk1 avec Aurora A qui est alors en mesure de phosphoryler le résidu Thr210 de Plk1.
Un second résidu impliqué dans l’activation de Plk1 est la Ser137 (Jang et al., 2002; van de Weerdt et al., 2005). La mutation Ser137Asp, qui mime un état phosphorylé de ce résidu, entraîne une augmentation de l’activité de Plk1.
Les phosphorylations des résidus Thr210 et Ser137 in vivo interviennent à différentes étapes de la mitose (van de Weerdt et al., 2005). La phosphorylation de la Thr210 est concomitante avec le pic d’expression de Plk1 (début de mitose), tandis que la phosphorylation de la Ser37 se produit dans une étape plus tardive de la mitose. Ces
phosphorylations consécutives de Plk1 sont nécessaires pour maintenir une exécution ordonnée des différents évènements mitotiques et éviter les catastrophes mitotiques. Le changement d’état de phosphorylation de Plk1 au cours de la mitose agirait sur sa spécificité de substrat : la phosphorylation du résidu Ser137, situé près de la position Ser/Thr-3 du substrat de Plk1, introduit une forte charge négative et augmente la sélectivité pour des résidus chargés positivement, tels qu’une Arginine ou une Lysine, en position -3 du substrat (Lowery et al., 2005). La phosphorylation de la Ser137 pourrait ainsi permettre la progression mitotique au-delà d’un point de contrôle de l’assemblage du fuseau mitotique (van de Weerdt et al., 2005).
L’activation de Plk1 est contrebalancée par PP1C (protein phosphatase 1C), qui se lie à une sous-unité régulatrice appelée MYPT1 (myosin phosphatase targeting subunit 1) (Archambault et al., 2008; Yamashiro et al., 2008). Au cours de la mitose, le complexe PPC1-MYPT1 est phosphorylé par Cdk1 sur son résidu Ser473, ce qui permet son association avec le PBD de Plk1. Ensuite, PP1C-MYPT1 inhibe probablement Plk1 directement par déphosphorylation du résidu Thr210. L’activité de phosphatase de PP1C-MYPT1 est contrôlée par sa phosphorylation par différentes kinases, telles que ZIP-like kinase, la Rho-kinase (ROCK), PAK et Aurora B. Ces Rho-kinases pourraient donc réguler l’activité de Plk1 de façon spatiotemporelle au cours de la division cellulaire. Ainsi, les kinases Rho, localisées au niveau des centrosomes, pourraient phosphoryler et inhiber PP1C-MYPT1 aux centrosomes, et donc activer Plk1. De même, Aurora B pourrait phosphoryler PP1C-MYPT1 au niveau des kinétochores avant la transition métaphase/anaphase et au niveau du fuseau équatorial au cours de la cytodiérèse. Ces phosphorylations entraîneraient l’activation spatiotemporelle de Plk1.
I-4 Régulation par le PBD et localisation intracellulaire
Le PBD de Plk1 a deux fonctions dans la régulation de cette kinase, à l’aide de deux mécanismes très différents.
Tout d’abord, le PBD est un domaine auto-inhibiteur (Lee and Erikson, 1997; Mundt et al., 1997; Garcia-Alvarez et al., 2007). La fin de la région C-terminale de Plk1 (583-603) porte un domaine inhibiteur de son activité kinase (Mundt et al., 1997). La délétion de cette séquence entraîne une activation de la kinase. L’inhibition par le PBD peut également être
