Le PBD de Plk1 a deux fonctions dans la régulation de cette kinase, à l’aide de deux mécanismes très différents.
Tout d’abord, le PBD est un domaine auto-inhibiteur (Lee and Erikson, 1997; Mundt et al., 1997; Garcia-Alvarez et al., 2007). La fin de la région C-terminale de Plk1 (583-603) porte un domaine inhibiteur de son activité kinase (Mundt et al., 1997). La délétion de cette séquence entraîne une activation de la kinase. L’inhibition par le PBD peut également être
levée par la phosphorylation de la Thr210, ou par la mutation de cette Thréonine en Aspartate (Jang et al., 2002). Il apparaît aussi que la liaison du motif phospho-peptidique reconnu spécifiquement par le PBD stimule l’activité de Plk1 (Elia et al., 2003b), suggérant un changement de conformation régulant Plk1. Johnson a récemment proposé un modèle des évènements activateurs de Plk1 (figure 9) (Johnson et al., 2008). Cette étude confirme que la phosphorylation de la Thr210 par Slk augmente le niveau d’activité de Plk1 (phosphorylation
in vitro de TCTP, un substrat connu de Plk1). Elle montre que la fixation d’un phospho-
peptide par le PBD entraîne également une activation de Plk1. Enfin, la phosphorylation du résidu Thr210 de Plk1 par Slk et la présence simultanée de phospho-peptide permet une activation maximale de Plk1 (par rapport aux quatre niveaux d’activité présentés dans cette étude). Le résidu Ser330, situé dans le lien entre le domaine kinase et le PBD, est également retrouvé phosphorylé dans cette étude, ainsi que d’autres résidus en plus faibles proportions. La fixation de Bora par le PBD de Plk1 aurait également pour effet de lever l’auto-inhibition de Plk1 par son PBD (Seki et al., 2008b).
Figure 9 : Modèle d’activation de Plk1 par Slk et par sa liaison avec un phosphopeptide (D'après Johnson et
al., 2008). Le niveau d’activité de Plk1 a été évalué par rapport à l’état de phosphorylation in vitro de TCTP, un substrat connu de Plk1. La phosphorylation de la Thréonine 210 par Slk tout comme la fixation d’un phospho- peptide par le PBD entraînent une augmentation de l’activité de Plk1. Cette activité est maximale lorsque les deux évènements sont couplés.
L’activation totale de Plk1 nécessite donc (i) la phosphorylation de résidus clefs de son domaine catalytique et les changements de conformation que ces phosphorylations induisent, (ii) les changements de conformation engendrés par l’interaction de son PBD avec un motif
phospho-peptidique spécifique présenté par son substrat ou une protéine située à proximité de ce substrat.
Ensuite, le PBD joue un rôle crucial dans la localisation sub-cellulaire de Plk1 (Song et al., 2000) ainsi que dans la sélection de ses substrats. Une mutation dans le domaine Polo- Box (PBD) de Plk1, qui n’affecte pas son activité catalytique mais abolit sa localisation sub- cellulaire, est capable d’abolir son activité biologique in vivo (Lee et al., 1998). En effet, la mutation W414F entraîne une perte de localisation de Plk1 au niveau des pôles mitotiques et des centrosomes, et une incapacité des cellules à accomplir la mitose.
Différentes études ont montré que le PBD de Plk1 forme un module de liaison de phospho-épitope permettant des interactions critiques pour une localisation sub-cellulaire correcte de Plk1 et pour l’interaction physique avec ses substrats. En effet, la localisation de Plk1, et donc son activité, sont régulées par l’intermédiaire d’interaction entre le PBD de Plk1 et différentes protéines tout au long de la mitose. Ainsi, Plk1 se localise au fuseau médian par l’intermédiaire de son PBD et de ses interactions avec la protéine de l’appareil de Golgi Nir2, les protéines de types kinésines Mklp1 et Mklp2 et la protéine du fuseau médian Cep55 (Neef et al., 2003; Litvak et al., 2004; Liu et al., 2004; Fabbro et al., 2005). Plk1 interagit également avec Cep170, une protéine localisée aux centrosomes en interphase, au niveau du centriole mère (Guarguaglini et al., 2005), et avec hCenexin1, une protéine localisée aux centrosomes au cours de la mitose (Soung et al., 2006). Diverses protéines, dont toutes ne sont pas identifiées actuellement, permettent donc de réguler la localisation de Plk1, qui varie au cours du cycle de division cellulaire. Ainsi, en interphase, Plk1 est située dans le cytoplasme (figure 10). Lors de la transition G2/M, elle est localisée dans le cytoplasme, de manière diffuse dans le noyau et elle est spécifiquement observée aux centrosomes (Golsteyn et al., 1995; Taniguchi et al., 2002). Elle apparaît liée à la tubuline au niveau des pôles du fuseau mitotique en fin de prophase et de métaphase, ainsi que sur les chromosomes au niveau des centromères (Pahlavan et al., 2000; Tsvetkov et al., 2003), puis sur le plan équatorial du fuseau en anaphase (Glover et al., 1998). Elle se maintient dans la région équatoriale jusqu’à la télophase, puis elle se concentre au niveau de l’anneau contractile au cours de la cytodiérèse, et enfin au niveau du pont post-mitotique reliant les deux cellules filles (Arnaud et al., 1998; Glover et al., 1998).
Figure 10 : Localisation de Plk1 au cours de la mitose. Plk1 est marquée en rouge et l’ADN en vert (D'après
van de Weerdt et al., 2006) Interphase : cytoplasmique, aucun marquage nucléaire. Prophase : au niveau des centrosomes et des chromosomes condensés. Prométaphase : au niveau des centrosomes et des centromères des chromosomes. Métaphase : au niveau des centrosomes et du fuseau mitotique. Anaphase : au niveau des centrosomes et de la plaque équatoriale. Télophase : au niveau du septum. Cytodiérèse : au niveau de l’anneau contractile puis du pont cytoplasmique.
L’action du PBD sur la localisation de la Plk1 est très précise. Elle permet non seulement de diriger Plk1 dans la région sub-cellulaire où son activité est nécessaire, mais également de conduire Plk1 à proximité, voire au contact de son substrat. Deux modèles, non exclusifs l’un de l’autre, proposent une explication pour la direction de l’activité catalytique de Plk1 par le PBD (figure 11) (Lowery et al., 2005). Dans le modèle de phosphorylation processive, le PBD se fixe à un phospho-épitope situé sur son substrat, puis le domaine kinase phosphoryle son résidu cible situé sur cette même protéine. Dans le modèle de phosphorylation distributrive, le PDB se fixe à un phospho-épitope situé sur une protéine faisant partie d’un complexe de protéines à la localisation bien spécifique. Ceci amène le domaine kinase au contact de son substrat, une seconde protéine du complexe protéique précédemment évoqué.
Figure 11 : Modèles de ciblage des substrats de la Plk1 par son PBD (D'après Lowery et al., 2005).
Modèle de phosphorylation processive : le PBD de Plk1 reconnaît un phospho-épitope sur son substrats et le fixe, ce qui permet de placer le résidu à phosphoryler au niveau du domaine kinase.
Modèle de phosphorylation distributive : le PBD de Plk1 reconnaît un phospho-épitope d’une protéine à proximité de son substrat (complexe) et le fixe, ce qui lui permet de se placer en position adéquate pour phosphoryler son substrat.
Une étude récente montre que les phospho-peptides optimums reconnus par les PBDs des Plk1, 2 et 3 diffèrent (van de Weerdt et al., 2005), indiquant une forte spécificité de cible et donc une redondance limitée entre les Plks des mammifères. L’utilisation du PBD de Plk1 comme agent de capture, suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, a permis de définir l’interactome de la Plk1 mitotique (Lowery et al., 2007). Ainsi, 662 protéines ont été identifiées pour leur interaction dépendante de phosphorylations mitotiques, incluant certains substrats connus de Plk1. Cette étude a permis d’identifier de nouveaux partenaires de Plk1, suggérant une implication dans des processus cellulaires dont elle était exclue jusqu’à présent (figure 12). La phosphorylation du phospho-épitope permettant la fixation du PBD de Plk1 ("priming") est généralement effectuée par Cdk1 ou par d’autres kinases (Cheng et al., 2003; Elia et al., 2003a; Elia et al., 2003b; Neef et al., 2007). Cependant, Plk1 peut auto-promouvoir sa localisation en générant son propre site de liaison du PDB (Neef et al., 2007) Lee et al., 2008). Cette situation est observée pour la localisation de Plk1 dans les étapes tardives de la mitose. Dans ce cas, une phosphorylation préliminaire du partenaire de Plk1 par Cdk1 inhibe l’interaction. Cette inhibition n’est levée que lorsque Cdk1 est désactivée en anaphase suite à la dégradation de sa sous-unité cycline B par la voie de l’APC/C. Plk1 phosphoryle alors son partenaire d’interaction, crée son propre phospho-épitope de reconnaissance par le PBD et se fixe sur ce partenaire.
Figure 12 : Interactome du PBD de Plk1. Seules les protéines interagissant avec la forme sauvage et qui
contiennent au moins un motif consensus de reconnaissance par le PBD sont présentées. Les protéines sont classées selon leur fonction biologique. Les protéines indiquées en bleu sont celles pour lesquelles au moins un motif consensus de reconnaissance par le PBD a été cartographié ; les protéines contenant également un site optimal de phosphorylation par Plk1 sont indiquées en bleu foncé, celles qui n'en possède pas en bleu clair. Pour les protéines restantes, celles contenant un site optimal de phosphorylation sont indiquées en violet et les autres en noir. Les partenaires de Plk1 déjà connus sont indiqués par un astérisque (D'après Lowery et al., 2007).