2-1 Le domaine kinase

Le domaine catalytique de Plk1 permet la phosphorylation de résidus Sérine et Thréonine. Une analyse des séquences de substrats de Plk1, suivie de l’optimisation d’un peptide pouvant servir de substrat à Plk1 a permis de définir une séquence consensus

phosphorylée par Plk1 (D/E-X-S/T-

Ψ

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Le domaine catalytique de Plk1 présente tous les motifs caractéristiques des Sérine/Thréonine kinases (Hanks et al., 1988), en particulier au niveau du sous-domaine VI (résidus HRDLKLG), et du sous-domaine VII (résidus GTPNYIVPE) (Clay et al., 1993; Golsteyn et al., 1994). Ce dernier, situé entre le globe N-terminal et le globe C-terminal du domaine kinase est fortement conservé et appelé boucle d’activation (T-loop). Il est retrouvé chez de nombreuses kinases (PKA, Cdk1/2, Aurora A/B…) et permet leur activation suite à la phosphorylation d’un résidu très conservé (Thr210, chez Plk1) (Johnson et al., 1996). Les résidus essentiels à la structure des protéines kinases sont conservés dans ce domaine catalytique, qui possède également des motifs caractéristiques et spécifiques de la famille des Polo-like kinases. Ainsi, la région permettant la fixation de l’ATP (poche ATP) possède un motif GxxGGxAxC (résidus 60 à 67), à la place de la séquence consensus CxGxxGxV retrouvée chez les autres kinases. Un autre résidu, la Sérine 137 (Ser137), joue quant à elle un rôle important dans la sélectivité des substrats, de fait de sa position dans le site de liaison de ces derniers (Jang et al., 2002).

Le domaine catalytique de Plk1 a été cristallographié récemment (Lowery et al., 2005; Kothe et al., 2007a). Suite à la difficulté de cristallisation de la forme sauvage du domaine kinase de Plk1, les auteurs se sont servis d’une forme mutante de Plk1, (T210V), à l’activité plus faible. La cristallisation a été réalisée en présence d’un analogue non hydrolysable de l’ATP (AMPPNP), afin de placer le domaine kinase dans une conformation active. L’analyse de la structure de ce cristal a permis de confirmer que le domaine kinase de Plk1 a une conformation fortement semblable à celle d’autres kinases dans leur état actif (PKA notamment) (figure 7A), ainsi que le suggérait un modèle proposé dans une publication antérieure (Lowery et al., 2005).

Le site de liaison de l’ATP est situé dans une poche formée entre le globe N-terminal (résidus 37 à 131) et le globe C-terminal (résidus 138 à 330). Le globe N-terminal est composé principalement de feuillets β anti-parallèles, et le globe C-terminal, d’hélices α. Les deux globes sont connectés par une région charnière sur laquelle repose les interactions avec les substrats liés. Les résidus 306 à 330 font partie du lien raccordant les domaines kinase et PBD de Plk1.

Figure 7 : Structure du domaine kinase de Plk1. A : Vue générale de la structure cristallisée du domaine

kinase de Plk1. Plk1 est indiquée par un ruban gris, avec les extensions N et C-terminales en orange par rapport au noyau du domaine kinase et la boucle d’activation est en vert. Les résidus Val210 de la boucle d’activation (Thr210 : premier site de phosphorylation dans la Plk1 sauvage) et S137 (probablement le second site de phosphorylation) sont indiqué en vert. B : Superposition du peptide substrat de PKA sur la structure de Plk1, avec des résidus sélectionnés. Les résidus sont indiqués par un code couleur. C : Mode d’interaction de la molécule d’AMPPNP avec la poche ATP de Plk1. Les deux conformations possibles du groupe phosphate sont représentées. Les ions magnésium présents dans le tampon de cristallisation sont indiqués par des sphères bleues claires. Les atomes des chaînes principales sont omis, à l’exception des résidus de la région charnière. Les chaînes latérales ne sont pas représentées pour les résidus indiqués entre parenthèses (d'après Kothe et al., 2007).

Le segment d’activation (résidus 194 à 221) est une boucle à la localisation centrale qui contribue dans une forte proportion au site de fixation du substrat (Lowery et al., 2007). Le résidu Thr210 est situé dans cette boucle d’activation. Sa phosphorylation stabilise la boucle d’activation dans une conformation ouverte et étendue qui permet la fixation du substrat. Des interactions de la phospho-thréonine avec un groupe adjacent contenant des chaînes latérales chargées positivement et un squelette d’azote jouent probablement un rôle dans l’alignement des globes N et C-terminaux du domaine kinase dans une conformation catalytiquement compétente ou dans l’orientation correcte et le positionnement de résidus catalytiques clefs (Johnson et al., 1996).

La Sérine 137 partage un contexte similaire à celui de la Thréonine 210. Elle a été proposée comme second site de phosphorylation de Plk1 (Jang et al., 2002). Une mutation de ce résidu en Aspartate augmente très fortement l’activité de la kinase. Le résidu Ser137 est

situé dans une poche entre la région charnière et l’hélice α D (figure 7A et B) (Kothe et al., 2007a). Elle est donc difficilement accessible pour une phosphorylation par des kinases sans changement conformationnel significatif et/ou des mouvements des deux globes de Plk1. Lors de l’interaction de Plk1 avec ses substrats, ce résidu se positionne près de la position Ser/Thr- 3 du substrat. Sa phosphorylation introduirait une forte charge négative et augmenterait la sélectivité de résidus chargés positivement, tels qu’une Arginine ou une Lysine, en position -3 du substrat. La phosphorylation du résidu Ser137 pourrait donc moduler la spécificité de Plk1, et conduire à la phosphorylation de cibles alternatives de Plk1 (Lowery et al., 2005). Le résidu correspondant chez PKA est un Glutamate, qui interagit bien avec une Arginine située en P-3 dans la structure cristalline de PKA (figure 7B).

La molécule d’AMPPNP est liée par différents nucléotides dans la poche ATP en accord avec la liaison observée pour d’autres kinases (Kothe et al., 2007a). La portion Adénine est orientée dans le site de liaison (figure 7C). Néanmoins, certains résidus situés dans cette poche différencient nettement Plk1 des autres kinases : le résidu Phe183, qui crée un encombrement au fond du site de liaison ; le résidu Cys67 plus petit sur le plafond de la poche ; le résidu Leu132 qui crée une poche dans la région charnière, et un groupe de résidus chargés positivement dans la région exposée au solvant à l’extérieur de la poche Adénine. L’originalité des caractères structuraux du site de fixation de l’ATP de Plk1 présente un atout majeur dans le cadre de la recherche d’inhibiteurs spécifiques de Plk1.