ETUDE TRANSCRIPTOMIQUE DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTANT A LA METHICILLINE (SARM)
par
Mireille Pruneau
memoire presente a la faculte des sciences
en vue de l'obtention du grade de maitre es sciences (M.Sc.)
FACULTE DES SCIENCES UNIVERSITE DE SHERBROOKE
1*1
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Le 26 septembre 2008
lejury a accepte le memoire de Mme Mireille Pruneau dans sa version finale.
Membres dujury M. Fraiwpois Malouin Directeur Departement de biologie M. Ryszard Brzezinski Membre Departement de biologie
Mme Carole Beaulieu President-rapporteur Departement de biologie
Sommaire
La resistance aux antibiotiques est un sujet d'actualite qui inquiete beaucoup la communaute scientifique et de plus en plus la population y est sensibilisee. Tres peu de nouveaux antibiotiques efficaces ont ete decouverts dans les dernieres annees et pendant ce temps, les souches bacteriennes developpent rapidement des resistances aux nouveaux composes et a ceux deja presents et ce, a de tres hauts niveaux. Nous sommes done confrontes de plus en plus a des bacteries multi-resistantes. Le cas du SARM (Staphylococcus aureus resistant a la methicilline) est particulierement inquietant puisque depuis leur apparition, la prevalence de ces souches ne cesse d'augmenter. Ces souches sont responsables de plusieurs infections nosocomiales et la plupart de ces souches sont maintenant multi-resistantes. L'apparition de ces souches dans la communaute (SARM-AC), bien quelles soient differentes de celles retrouvees en milieu hospitalier, est particulierement inquietante, ces souches affectant des hotes n'ayant aucun facteur de risque. Dans notre etude, nous avons compare les profils transcriptomiques de souches cliniques de SARM multi-resistantes avec des souches prototypes sensibles afm d'identifier les genes pouvant supporter la resistance et la virulence du SARM. Cette etude nous a permis de constater que les souches de SARM se ressemblaient entre elles, mais qu'il existait plusieurs genes de resistance et de virulence modules differemment chez les souches de SARM de l'etude en comparaison avec les souches prototypes. Nous avons done dresse un profil transcriptomique des souches de SARM cliniques multi-resistantes, ce profil representant un atout important pour la caracterisation de ces souches et pour le developpement de nouveaux traitements contre le SARM.
Remerciements
Je tiens a remercier mon directeur de recherche, M. Francois Malouin, Ph.D. pour m'avoir donne l'opportunite de travailler sur un projet de maitrise aussi passionnant, pour son enthousiasme et son soutien qui ont permis de mener a terme ce projet. Je remercie aussi mes conseillers de maitrise, M. Ryszard Brzezinski Ph.D. et Mme Carole Beaulieu Ph.D. qui ont veille au bon deroulement du projet et l'ont nourri de suggestions eclairees. Je remercie egalement le VRQ (Valorisation Recherche Quebec) pour leur soutien financier. Je remercie aussi tous les membres du laboratoire qui ont participe de pres ou de loin au projet, leur presence fut un atout essentiel. Finalement, je remercie plus particulierement Helene Moisan M.Sc. et Marianne Allard M.Sc. pour la mise au point des puces a ADN mais surtout, pour leur amitie.
Table des matieres
Sommaire ii Remerciements iii Table des matieres iv Liste des tableaux vi Liste des figures vii CHAPITRE 1. PATHOGENESEDE STAPHYLOCOCCUS AUREUS 1
1.1 Description du pathogene Staphylococcus aureus 1
1.2 Pathogenese de Staphylococcus aureus 2
1.2.1 Capacite d'adhesion 2 1.2.2 Internalisation 4 1.2.3 Formation de biofilms 4
1.2.4 Production des facteurs de virulence 6 CHAPITRE 2. LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES 14
2.1 Classes d'antibiotiques disponibles 14 2.2 Mecanismes de resistance aux antibiotiques 14
2.2.1 Modification de la cible cellulaire de l'antibiotique 15
2.2.2 Inactivation enzymatique 16 2.2.3 Modification de la permeabilite cellulaire 18
2.3 Aspects moleculaires de la resistance a la methicilline 22
2.3.1 Cassette mec (SCCmec) 23 2.4 Aspects moleculaires de la resistance a la vancomycine 26
CHAPITRE 3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTANT A LA METHICILLINE
(SARM) 29 3.1 Evolution et adaptation du SARM 29
3.1.1 Resistance et virulence des SARM 31 3.2 Phenotypes de Staphylococcus aureus resistant a la methicilline 34
3.3 Susceptibilite a l'autolyse et a la lysostaphine 35 3.4 Caracteristiques du peptidoglycane chez les souches resistantes a la methicilline 37
3.4.1 Implication des PBPs modifiees 39 3.4.2 Implication des gbnesfem 40 3.5 Cout physiologique associe a la resistance 42
3.5.1 Capacite physiologique du SARM 43
3.5.2 Mutations compensatoires 44 CHAPITRE 4. ETUDES TRANSCRIPTOMIQUES 46
4.1 Utilisation des puces a ADN 46 4.1.1 Description de lamethode 46 4.1.2 Travaux portant sur S. aureus utilisant les puces a ADN 49
CHAPITRE 5. L'ARTICLE SCIENTIFIQUE 52
5.1 Resume en francais de l'article 52 5.1.1 Contribution des auteurs 53
5.2 L'article scientifique 54
Liste des tableaux
Tableau 1. Exemples de facteurs de virulence regules par differents systemes chez S.
aureus 12
Tableau 2. Exemples de classes d'antibiotiques et leur mode d'action 14 Tableau 3. Exemple de pompes a efflux retrouvees chez S. aureus et autres especes avec
leurs substrats respectifs 20 Tableau 4. Caracteristiques des souches de SARM acquises en communaute et en milieu
Liste des figures
Figure 1. Organisation du locus agr et interaction entre ses composantes 7 Figure 2. Activation du systeme agr et production des differents facteurs de virulence en
fonction de la croissance bacterienne 8 Figure 3. Representation graphique de 1'expression hypothetique des facteurs de
virulence dans le temps chez certaines souches resistantes et chroniques de S. aureus. ..10
Figure 4. Element bla : Mode d'action de la jS-lactamase sur la penicilline 17
Figure 5. Representation schematique depompes a efflux 19 Figure 6. Polymorphisme des cassettes mec I a V presentes chez Staphylococcus aureus
resistant a la methicilline 25 Figure 7. Representation du modele propose pour la resistance aux glycopeptides chez S.
aureus 27
Figure 8. Representation schematique de revolution de la resistance aux antibiotiques
dans le temps chez S. aureus 29 Figure 9. Phenotypes de resistance a la methicilline presents chez S. aureus 35
Figure 10. Structure de base du peptidoglycane chez S. aureus 38 Figure 11. Implication des genes fern dans la synthese du peptidoglycane 42
Figure 12. Taux de croissance du SARM en fonction du niveau de susceptibilite a
1'oxacilline 43 Figure 13. Principales etapes d'une experience de puce a ADN 47
Introduction
CHAPITRE 1. PATHOGENESE DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
1.1 Description du pathogene Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus est une bacterie a Gram positif anaerobique facultatif, a la structure de coque, dont rarrangement est sous forme de grappes. II s'agit d'un parasite de la peau et des membranes muqueuses de l'homme et des animaux a sang chaud. On le definit comme un agent pathogene opportuniste de la flore normale puisqu'il peut se retrouver sur la peau des hommes sans jamais causer de pathologies (porteurs sains) mais egalement profiter d'une faiblesse du systeme immunitaire du porteur pour s'introduire et causer alors plusieurs types d'infections. Cette caracteristique facilite et favorise grandement sa propagation, puisque Ton peut etre porteur sans en etre conscient. Selon certaines etudes, on evalue a pres de 20% le nombre de porteurs chroniques de S. aureus, a 60% le nombre de porteurs occasionnels et a environ 20% les non-porteurs (Kluytmans et al., 1997). Les infections causees par S. aureus sont nombreuses, diversifies et le degre de gravite de ces infections Test tout autant. La capacite de cet agent pathogene de pouvoir produire plusieurs types de facteurs de virulence, qu'ils soient associes a la surface cellulaire ou encore secretes, lui permet de causer cette large gamme de symptomes. II est responsable entre autres de plusieurs infections de la peau qui se traduisent par des lesions parfois graves, mais aussi d'empoisonnement alimentaire, d'endocardite, d'osteomyelite, de pneumonie, de septicemic, du syndrome du choc toxique, de mammite chez les humains et les bovins et peut aller jusqu'a entrainer la mort de son hote (Lowy, 1998).
1.2 Pathogenese de Staphylococcus aureus
La pathogenese microbienne implique plusieurs etapes debutant par 1'adhesion et la colonisation des tissus de l'hote suivi de la destruction locale des tissus et, lorsque possible, de l'invasion. Les staphylocoques sont munis de plusieurs facteurs de virulence, autant des proteines de surface qui permettent l'adhesion et la colonisation des tissus, que d'enzymes et toxines qui favorisent la destruction tissulaire, l'invasion et l'infection. S.
aureus possede plusieurs de ces facteurs, dont l'expression est controlee par differents
systemes de regulation qui interagissent egalement entre eux, ce qui en fait une bacterie pathogene complexe, bien equipee pour infecter et persister.
1.2.1 Capacite d'adhesion
L'adhesion des bacteries aux cellules de l'hote est une etape importante pour l'initiation de l'infection et joue un role considerable dans la colonisation. S. aureus peut produire plusieurs types de proteines d'adhesion dont l'expression, de meme que les interactions de ces proteines d'adhesion avec les cellules de l'hote, implique des procedes complexes.
S. aureus peut se lier a plusieurs proteines dont les principales sont la fibronectine, le
fibrinogene, le collagene et l'elastine mais les bases moleculaires de certaines de ces interactions sont encore mal comprises (Roche et al., 2003). Plusieurs proteines d'adhesion de S. aureus sont par contre caracterisees dont la proteine A (spa) qui se lie a la partie Fc de l'immunoglobuline, les proteines se liant a la fibronectine (FnbpA et FnbpB, celles se liant au fibrinogene, (ClfA, ClfB, Efb) et au collagene (Cnaj (Savolainen
et al, 2001). II semble egalement que la capacite d'adhesion aux cellules de l'hote peut
differer d'une souche a l'autre pour une meme espece bacterienne. Par exemple, certaines souches de S. aureus produiraient une quantite differente de ces proteines d'adhesion, ce qui leur confereraient une capacite d'adhesion amelioree ou reduite dans certains cas.
Quelques souches de S. aureus resistantes a la methicilline, aussi appelees SARM (Section 3.1) obtenues en laboratoire seraient deficientes au niveau de la production de certaines proteines impliquees dans la colonisation et 1'adhesion tel que la proteine A. En comparant des souches resistantes obtenues par l'insertion de l'element mec (element genetique conferant la resistance a la methicilline) et sensibles a la methicilline, on note egalement chez les souches resistantes une diminution significative de l'attachement a la fibronectine (Vaudaux et al, 1988). Chez d'autres souches resistantes obtenues in vitro, suite a l'introduction du gene mecA seul, gene habituellement retrouve sur l'element mec, le phenotype d'adhesion est normal en comparaison avec des souches resistantes contenant l'element mec dans leur genome ou l'adhesion est deficiente. Ces resultats indiquent que la deficience au niveau de l'adhesion a la fibronectine n'est pas due a la presence du gene mecA mais plutot a une autre composante de l'element mec, encore non identifiee comme responsable (Vaudaux et al., 1988).
L'equipe de Savolainen et al. (2001) note que chez les souches resistantes, on retrouve une nouvelle proteine de surface appelee Pis (Savolainen et al., 2001). Leurs resultats suggerent que le phenotype d'adhesion deficiente soit du a la presence du gene pis. Ce gene encode une proteine qui possede des sequences repetees qui sont souvent caracteristiques de proteines de surface ayant un role a jouer dans l'adhesion. Pis par contre, semble fonctionner comme une anti-adhesine (Savolainen et al., 2001). Ce gene, retrouve seulement chez les souches resistantes a la methicilline, est situee dans la meme region que mecA et, puisqu'il est conserve dans revolution, semble avoir un role benefique. L'equipe de Roche et al. (2003) avance que Pis, aussi appelee SasG, promeut l'adhesion aux cellules epitheliales nasales (recepteur non-identifie), mais reduit l'adherence a la fibronectine et au fibrinogene (Roche et al., 2003). Les souches de SARM seraient done plus aptes a s'attacher aux cellules epitheliales.
1.2.2 Internalisation
En plus de pouvoir se Her aux cellules de l'hote, S. aureus est depuis peu reconnu comme une bacterie pathogene capable de survivre et se multiplier a l'interieur de plusieurs de ces cellules. Cette capacite d'etre internalise par les cellules non phagocytaires permet au pathogene d'echapper aux mecanismes de defenses de l'hote ainsi qu'aux traitements antibiotiques (Bayles et al, 1998; Clement et al, 2005; Brouillette et al, 2003).
Dans les cas d'infections chroniques et difficiles a traiter a S. aureus, comme les infections par les SCV (S. aureus small-colony variants) ou par les souches de SARM, il a ete demontre que 1'internalisation, ainsi que la persistance dans les cellules epitheliales tend a etre plus efficace que chez certaines souches prototypes (Moisan et al., 2006, Pruneau et al., soumis a International Journal of Medical Microbiology). Dans ces deux etudes, on note egalement une surexpression de certaines adhesines, ce qui pourrait faciliter 1'internalisation et la capacite de cet agent pathogene a survivre a l'interieur des cellules de l'hote ce qui rend alors le traitement plus difficile.
1.2.3 Formation de biofilms
La formation de biofilm est possible lorsqu'il y a certaine densite de microorganismes capable de secreter une matrice adhesive sur une surface donnee. L'initiation de la production des biofilms semble etre une reponse a certains facteurs externes dont la disponibilite des nutriments, le pH et la temperature environnante (Trontonda et al., 2005). Elle commence par un attachement primaire des microorganismes sur cette surface par le biais d'interactions moleculaires faibles, puis peut devenir plus stable et permanent, si les conditions sont favorables, menant alors a un agregat cellulaire (Heilmann et al.,
1996). Les biofilms sont tres repandus dans le milieu hospitalier et causent plusieurs problemes notamment lorsqu'ils se forment sur le materiel medical comme les catheters
ou les protheses, formant ainsi un reservoir de bacteries pathogenes pouvant causer l'initiation et la propagation d'infections nosocomiales.
La presence de biofilms est souvent observee lors d'infections persistantes et difficiles a traiter, dont celles causees par S. aureus qui est un agent infectieux ayant la capacite de produre des biofilms (Costerton et al., 1999; Cucarella et al., 2004). Le mecanisme de formation de biofilms chez les souches de S. aureus est complexe et dependant de la collaboration inter-reliee des systemes d'expression des facteurs de virulence (Gotz, 2002). Cette association entre les systemes de regulation mene a l'eclosion des biofilms. Chez certaines souches, elle implique plus particulierement une proteine de surface, Bap (Biofilms associated protein) dont l'expression est controlee par un des systemes de regulation des facteurs de virulence, SarA (Staphylococcal accessory regulator) (Trotonda et al., 2005). Chez les souches de S. aureus retrouvees chez les bovins, il a ete demontre que la presence de bap ameliore leur capacite d'infecter et de persister dans les glandes mammaires (Cucarella et al., 2004). D'autre part, plusieurs etudes s'entendent pour dire que l'operon icaADBC, dont l'expression est controlee en partie par le facteur transcriptionnel alternatif SigB (sigma B ou <7B) aurait un role important a jouer dans la
production de biofilms. L'operon icaADBC controle la synthese de PIA (polysaccharide intracellular adhesin) le compose majeur retrouve dans les biofilms (Gotz, 2002; Beenken
et al., 2004). Le systeme agr (accessory gene regulator) est egalement implique dans la
regulation de cette production de biofilms. Dependant de la densite cellulaire, l'activation du systeme induit la production de toxines au depend des proteines de surface impliquees dans l'adhesion. Chez des souches dont l'expression du systeme agr est induite a de hauts niveaux, on note une reduction dans la production de biofilms (Beenken et al., 2004).
En general, les staphylocoques, incluant Staphylococcus aureus resistant a la methicilline (SARM), ont la capacite de former des biofilms sur differents materiaux. Par leur taille, les biofilms sont resistants a la phagocytose et procurent aussi une protection contre les antibiotiques (Cucarella et al., 2004). La formation de biofilms permet alors une meilleure chance de survie dans l'environnement et une resistance accrue aux
antibiotiques (Ando et al, 2004). Moins de 5% (4.6%) des souches de SARM ne forment aucun biofilm (Ando et al., 2004). Cette strategie augmente leur capacite de persistance. Chez les souches de S. aureus presentant un phenotype de resistance intermediate a la vancomycine, la capacite de produire des biofilms serait egalement augmentee (Sakoulas
et al., 2002). La diminution d'expression du systeme agr, favorisant ainsi la colonisation
et l'adhesion, confererait une habilete accrae pour ces souches d'adherer a differents materiaux.
1.2.4 Production des facteurs de virulence
S. aureus est une baterie pathogene pouvant causer plusieurs types d'infections, soit des
infections superficielles, systemiques ou resultant d'une intoxication (Novick, 2000). Cette capacite de causer plusieurs types d'infections est due aux nombreux facteurs de virulence produits (Yarwood et al., 2002). La pathogenese de S. aureus est complexe et implique un bon nombre de facteurs de virulence differents, soit ceux impliques dans l'adhesion et ceux impliques dans la colonisation ou encore dans la destruction des tissus. Pour controler ces multiples facteurs de virulence, cette bacterie possede differents systemes de regulation. Ces systemes de regulation des facteurs de virulence sont exprimes differemment selon le type d'infection et le stade de l'infection (Yarwood et al., 2002).
1.2.4.1 Systemes de regulation des facteurs de virulence
L'expression des facteurs de virulence de S. aureus est regulee par differents systemes dont le systeme agr (accessory gene regulator), sar (staphylococcal accessory
regulator), sigB (alternate sigma factor B), sae (S. aureus exoprotein expression), arl et
aureus, en coordination avec les phases de croissance, dependant de la densite cellulaire.
Le locus agr (Figure 1) est active par un ligand dependant de la densite bacterienne, le peptide auto-inducteur (AIP i.e., autoinducing peptide) produit par le systeme agr lui-meme. Le promoteur P2 permet la transcription de l'ARN II qui code pour AgrA, AgrB, AgrC et AgrD (Novick, 2000). Les genes AgrB et AgrD permettent la production du peptide auto-inducteur qui va ensuite se Her au recepteur AgrC et declencher une cascade de phosphorylation activatrice. Durant la phase exponentielle, il y a accumulation du peptide auto-inducteur (systeme de type quorum-sensing) puis synthese de l'ARNIII, la molecule effectrice (Yarwood et ah, 2002). C'est le promoteur P3 qui initie, dans la direction opposee, la transcription de l'ARN III qui code pour la 8-hemolysine (Novick, 2000). L'activite des promoteurs P2 et P3 augmente progressivement pendant la phase de croissance exponentielle pour atteindre un maximum en phase post-exponentielle.
Production du peptide auto-inducteur (AIP)
-i_: agr A
Liaison du peptide auto-inducteur avec son recepteur AgrC, ce qui
entraine sa phosphorylation J AIP \ AgrC I An-ogiC N.. .y * *1»
1
Le phosphate est transfere a AgrA
Expression de l'operon Agr et du regulateur ARNIII
RNAIII (hid)
Figure 1. Organisation du locus agr et interaction entre ses composantes. (Figure modifiee de Fuqua et al, 2002).
Une fois active par le signal intracellulaire, le systeme agr va generalement favoriser la production des facteurs de virulence secretees au depend des adhesines et autres facteurs de virulence associes a la surface cellulaire (Sakoulas et al, 2003; Yarwood et al., 2003). Lors de la phase exponentielle de croissance, ce systeme active l'expression des proteines de surface impliquees dans la colonisation de l'hote (proteine A, coagulase, proteines liant le fibrinogene et autres adhesines). Ensuite, en phase post-exponentielle, l'expression des proteines de surface est diminuee pour activer l'expression des proteines extracellulaires (hemolysines, nucleases, lipases, diverses toxines et enzymes hydrolytiques) (Figure 2). L'importance de ce systeme a ete demontree maintes fois par des etudes sur differents modeles d'infection in vivo ou la virulence de souches mutantes pour ce systeme etait fortement diminuee (Novick, 2000).
exponentielle post-exponentiel
TEMPS > .
II existe egalement une variation dans les sequences des acides amines du peptide auto-inducteur ainsi que dans celle de son recepteur, AgrC, ce qui entraine un polymorphisme du systeme agr dans la population de S. aureus (Jarraud et al., 2001; Lina et al., 2003). Les souches de S. aureus sont alors classes en 4 groupes ou types agr, identifies agr-l a
agr-IV. Certaines infections ou types de souches sont associes a un type agr en
particulier. Par exemple la plupart des chocs toxiques associes aux menstruations sont causes par des souches de type III alors que la majorite des souches VISA (S. aureus resistant intermediate a la vancomycine) sont de type II (Novick, 2003).
Plusieurs travaux portant sur l'expression des systemes de regulation de S. aureus in vivo tendent a demontrer que le systeme agr serait inactif dans ces conditions (Goerke et al., 2000). Les travaux de Goerke et al. (2000) demontrent que l'ARNIII, la molecule effectrice du systeme agr, est faiblement exprime in vivo, du moins pour certaines souches de S. aureus retrouvees chez des patients atteints de fibrose kystique. Le gene
spa (proteine A), dont l'induction est diminuee avec l'activation du syteme agr est
faiblement exprime in vivo mais suit l'induction predite in vitro. Autre gene regule par le systeme agr, hla (alpha toxine) qui est normalement induit par l'activation du systeme, est induit in vivo et in vitro, chez des souches dont le systeme agr est deficient, au meme niveau que pour des souches dont le systeme est fonctionnel. De plus, aucune correlation entre la densite des cellules et l'ARNIII n'a pu etre observee, le systeme agr etant alors considere comme inactif ou non-necessaire dans ce type d'infection. L'autre hypothese emise serait que le systeme de regulation in vivo serait beaucoup plus complexe que la seule implication du systeme agr. Les conclusions des travaux de Yarwood et al. (2002) vont egalement dans le meme sens ou, en comparant l'expression des genes de S. aureus
in vivo {i.e. chambre de diffusion sous-cutane insere dans un lapin immunise ou non avec
l'enterotoxine B de S. aureus) versus l'expression en milieu de culture in vitro, on note une repression importante de l'ARNIII la molecule effectrice du systeme agr (Yarwood
par le modele de regulation d'agr mais, le niveau d'alpha-hemolysine semble independant de 1'activation du systeme agr.
Nos etudes transcriptomiques demontrent que chez les souches cliniques de S. aureus resistantes a la methicilline, le systeme agr est induit mais de facon beaucoup moins significative que chez les souches prototypes (Pruneau et al., soumis a International Journal of Medical Microbiology). L'induction de ce systeme semble aussi etre reduite chez les SCV (S. aureus small-colony variants) cliniques provenant de patients atteints de fibrose kystique (Moisan et ah, 2006). De plus, plusieurs des facteurs de virulence controles par agr suivent une modulation d'un systeme non-induit chez ces souches. Les souches cliniques multi-resistantes de SARM, comme les souches causant des infections chroniques, semblent done rester « coincees » dans la premiere phase d'infection, qui preconise la colonisation et la persistance, plutot que la destruction et l'invasion des tissus (Figure 3). ot-hemolysine P-hemolysine Enterotoxines-TSST Lipase Nuclease Serine proteases Metalloprotease PHASE 2: •Virulence
•Destruction des tissus • Invasion
•Colonisation
•Persistance Intracelullaire
II existe un autre systeme de regulation important, SarA {Staphylococcal accessory
regulator A) qui active la transcription de plusieurs genes incluant spa (proteine A), fnb
(fibronectin-binding protein) ou encore le systeme agr lui-meme. En effet, SarA peut se lier a la region promotrice d'agr pour activer la transcription de l'ARNIII (Figure 1) (Rossi et al., 2003). La synthese des proteases extracellulaires est reduite par sarA, contrairement a agr qui l'active (Karlsson et al., 2001).
Le systeme rot {repressor of toxins), qui implique un regulateur homologue a SarA, est egalement un systeme de regulation important chez S. aureus. En comparant les transcriptomes du double mutant agr rot avec sa souche parentale agr, 1'etude de Sai'd-Salim et al. (2003) demontre que le regulateur rot regule a lui seul un nombre important de genes chez S. aureus. En effet, cette etude a identifie 60 genes dont 1'expression est regulee negativement et 86 genes dont l'expression est regulee positivement par Rot (Sai'd-Salim et al., 2003). Done, malgre ce qu'indique son nom, il n'agit pas seulement comme represseur mais agit plutot comme regulateur positif et negatif de plusieurs facteurs de virulence. Souvent, l'activation du regulateur Rot entraine des effets opposes a l'activation du systeme agr sur l'expression des facteurs de virulence (Tableau 1). Par exemple, l'expression des genes codant pour proteine A et la protease SspB est diminuee par l'activation d'agr mais augmentee par celle de rot alors que le gene hla est sur exprime par l'activation d'agr et sous exprime par rot. Le plus souvent, les proteines secretees exprimees plus tardivement dans l'infection, tels les toxines, sont regulees a la baisse par rot alors que les adhesines sont regulees a la hausse par ce regulateur (Sai'd-Salim et al., 2003). En ce sens, rot favoriserait plutot la colonisation et la persistance dans l'hote. De plus, chez certaines souches cliniques de SARM multi-resistantes causant des infections persistantes et difficiles a traiter, le regulateur de transcription rot est surexprime en comparaison avec les souches prototypes sensibles (Pruneau et al., soumis a International Journal of Medical Microbiology).
Une fois active, le systeme agr induit la production des toxines et autres proteines secretees au depend de la production d'adhesines et autres proteines favorisant la colonisation. De plus, le systeme sarA regule egalement la production des facteurs de virulence, en plus d'interagir directement avec le systeme agr. Finalement, l'activation du systeme rot semble avoir plutot des effets contraires a l'activation d'agr. L'interaction entre tous ces systemes est done complexe. Le tableau 1 montre quelques exemples de facteurs de virulence regules par agr, mais aussi l'influence des autres regulateurs sur l'expression de ces memes genes.
Tableau 1. Exemples de facteurs de virulence regules par differents systemes chez S.
aureus (Informations tirees de Novick, 2000; Novick, 2003; Sai'd-Salim et al., 2003;
Bronner et al, 2004). Regulateur Gene aur cap5 coa etb fine fnbA etfnbB geh hla Mb hid hlgA lip seb sec sed spa sspA tst Description Metalloprotease Polysaccharide capsule Coagulase Exfoliatine B FAME type 5
Proteine liant la fibronectine Lipase Alpha toxine Beta hemolysine Delta hemolysine Gamma hemolysine Lipase Enterotoxine B Enterotoxine C Enterotoxine D Proteine A Serine Protease TSST-1 Agr + + -+ + -+ + + + + + + + + -+ + Rot + -+ SarA -+ + + + + + + + + -+
Finalement, le facteur a influence l'expression de plusieurs genes, dont certains sont lies a la virulence, en plus d'etre implique dans la reponse generate au stress. De plus, il a ete demontre que ce regulateur influence d'autres systemes de regulation tel que sar et agr (Bischoff et al., 2004). Chez les souches de SCV cliniques, il semble que le regulateur
agr soit moins induit, contrairement a ffB qui aurait un important role a jouer dans cette
CHAPITRE 2. LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES
2.1 Classes d'antibiotiques disponibles
Depuis la decouverte de la penicilline, le premier antibiotique decouvert par Alexandre Fleming en 1929, la gamme d'antibiotiques disponibles s'est largement developpee. On retrouve aujourd'hui de nombreuses classes d'antibiotiques d'origine naturelle et synthetique. Les classes d'antibiotiques les plus couramment utilises, ainsi que leurs modes d'action, sont exposes dans le tableau 2.
Tableau 2. Exemples de classes d'antibiotiques et leur mode d'action.
Classe d'antibiotique Antibiotique Mode d'action
Aminoglycosides Gentamicine Inhibition de la synthese proteique par liaison a la sous-unite 30S du ribosome Beta-lactamines Penicilline, Oxacilline Inhibition de la synthese du peptidoglycan
Glycopeptides Vancomycine, Teicoplanine Inhibition de la synthese du peptidoglycan
Macrolides Erythromycine Inhibition de la synthese proteique par liaison a la sous-unite 50S du ribosome Quinolones Ciprofloxacin, Norfloxacin Interference dans la synthese d'ADN, inhibition de l'ADN gyrase et topoisomerase Tetracyclines Tetracycline Inhibition de la synthese proteique par liaison a la sous-unite 30S du ribosome
2.2 Mecanismes de resistance aux antibiotiques
Selon les differents mecanismes d'action des antibiotiques, les microorganismes ont su developper des strategies particulieres pour les detourner. Plusieurs processus menant a la resistance se rejoignent dans leurs precedes alors il devient possible de les regrouper en de grandes classes de mecanismes qui seront decrits dans les sections qui suivent. Pour un meme antibiotique, il est possible de retrouver une combinaison de mecanismes, ce qui rend la defense encore plus efficace.
2.2.1 Modification de la cible cellulaire de l'antibiotique
Les types d'antibiotiques disponibles ayant un procede propre et different d'une classe a l'autre, il est alors possible de modifier de facon bien precise la cible cellulaire d'un antibiotique. Les modifications apportes a la cible cellulaire d'un antibiotique ont pour effet de diminuer l'affinite de l'antibiotique avec celle-ci et done, son efficacite.
Le mecanisme de resistance a la penicilline implique parfois une modification de la cible de l'antibiotique, soit les PBP (Penicillin-Binding Protein), impliquees dans la synthese du peptidoglycane. Des changements dans certains acides amines impliques au site actif de la PBP peuvent diminuer l'affmite de l'antibiotique pour la proteine. On retrouve aussi chez les especes resistantes une substitution fonctionnelle donnant priorite aux PBPs ayant une faible affmite pour la penicilline. Par exemple, les enterocoques (E.faecium, E.
faecalis, E. durans) sur-expriment la PBP5, qui possede une faible affinite pour la
penicilline et devient prioritaire en depit des autres PBPs presentes (Fontana et al, 1994). Ce mecanisme de resistance est semblable a celui retrouve chez les souches de S. aureus resistantes a la penicilline/methicilline ou la PBP2a quoique acquise par insertion d'un element genetique mobile (voir section 2.3.1), prend en charge la synthese du peptidoglycane au depend des autres PBPs qui se trouvent inactivees en presence de l'antibiotique (Chapitre 3).
II existe differents mecanismes entrainant la resistance a la tetracycline, dont un impliquant une modification de la cible cellulaire de cet antibiotique, les ribosomes. Certaines bacteries resistantes produisent une proteine intracellulaire qui va se lier aux ribosomes et permet alors a ceux-ci de continuer la synthese proteique, meme en presence d'une concentration intracellulaire elevee de tetracycline (Speer et al., 1992).
La resistance aux quinolones peut egalement etre engendree par une modification de la cible de l'antibiotique. Les quinolones agissent habituellement en se liant au complexe forme par l'ADN et l'enzyme responsable de sa conformation, la gyrase ou la topoisomerase IV. En se liant a ce complexe, l'antibiotique induit un changement de conformation et conduit a la formation d'un nouveau complexe quinolone-ADN-gyrase qui inhibe alors la replication de l'ADN (Hawkey et al., 2003). La resistance aux quinolones se produit lorsqu'il y a mutation dans les genes qui codent pour ces enzymes (gyrase ou topoisomerases) et conduit a une alteration du site de liaison pour empecher le nouveau complexe de se former (Schmitz et al, 2002).
2.2.2 Inactivation enzymatique
La resistance aux antibiotiques peut survenir lorsqu'il y a degradation ou inactivation du compose par des enzymes produites par l'espece resistante. Tel que mentionne dans la section 2.2.1, la resistance a la tetracycline peut etre due a differents mecanismes de resistance dont une inactivation enzymatique. En effet, certaines bacteries resistantes produisent une enzyme capable de modifier la tetracycline en une forme inactive qui diffuse alors librement hors de la cellule (Speer et al., 1992).
La resistance aux macrolides, lincosamides et streptogramines (MLS) est un autre exemple commun d'une modification enzymatique de l'antibiotique. Ces composes agissent habituellement en inhibant la synthese proteique (Tableau 2). La resistance survient lorsqu'il y a acquisition des genes erm, codant pour les enzymes (methyltransferases) capables de modifier la cible. Les methyltransferases Erm catalysent la methylation d'un site specifique de l'ARNr. Ce groupement methyle encombre le site de liaison des MLS et brise le lien hydrogene forme entre l'antibiotique et l'ARNr, ce qui rend la bacterie resistante (Maravic, 2004).
Chez S. aureus, la resistance a la penicilline implique egalement un processus d'inactivation enzymatique. Les souches resistantes possedent l'element genetique bla contenant le gene blaZ qui code pour une /3-lactamase capable d'hydrolyser la penicilline, ce qui la rend inactive (Figure 4).
Region operatrice
Penicilline 1 Penicilline C* ^1
inactive actjVe
Figure 4. Element bla : Mode d'action de la /3-lactamase sur la penicilline (figure modifiee de Lowy, 2003).
Le mecanisme de resistance aux aminoglycosides est egalement lie a une modification enzymatique qui rend les composes incapables de se Her a leurs cibles, les ribosomes (Davies et al., 1978; Ida et al, 2001). Chez les souches de SARM resistant aux aminoglycosides on retrouve l'aminoglycoside-6'-A^-acetyltransferase et la 2"-0-phosphotransferase (AAC(6')-APH(2")) qui inactivent cette classe de composes.
2.2.3 Modification de la permeabilite cellulaire
Par leur difference structurale, les bacteries a Gram positif et negatif n'offrent pas la meme permeabilite cellulaire. En effet, les bacteries a Gram positif sont entourees d'une couche epaisse de peptidoglycane, mais la structure de celle-ci laisse facilement passer les molecules de petites tailles comme les antibiotiques. Par contre, les bacteries a Gram negatif possedent une deuxieme barriere qui est composee de LPS (lipopolysaccharide) chargee negativement, ce qui limite 1'entree des antibiotiques hydrophobiques (Hogan et Kolter, 2002). Pour modifier leur susceptibilite aux antibiotiques et autres composes toxiques, les bacteries peuvent modifier leur permeabilite naturelle afin de reduire la concentration intracellulaire du compose qui leur est toxique. Pour ce, les bacteries a Gram negatif modifient parfois certaines de leurs porines membranaires par mutation ou encore au niveau de leur expression, ce qui augmente l'impermeabilite de la cellule. Le plus souvent, les bacteries utilisent des proteines situees dans la membrane, a la surface de la cellule, les pompes a efflux, pour faire sortir les composes indesirables, dont les antibiotiques.
2.2.3.1 Pompes a efflux
Les pompes a efflux procaryotes sont des proteines de transport impliquees dans l'exportation de certains composes toxiques hors de la cellule. Certaines pompes a efflux peuvent reconnaitre et exporter les antibiotiques hors de la cellule, il survient alors une reduction de la concentration intracellulaire de l'antibiotique et done, la resistance a cet antibiotique. Les genes codant pour les pompes a efflux sont retrouves dans le chromosome ou encore sur des elements genetiques transmissibles tels que les plasmides (Piddock, 2006). Lorsque retrouves sur les elements genetiques mobiles, les genes codant pour les pompes a efflux peuvent etre transferes d'une souche a 1'autre, ce qui entraine la propagation de la resistance au sein d'une meme espece mais aussi entres les especes. Les
souche sensible peut devenir resistante en sur-exprimant certaines pompes (Piddock, 2006). Elles reconnaissent un substrat precis ou parfois une gamme de substrats. L'activite de ces pompes peut dans certains cas etre induite suite a l'exposition a ces substrats (Webber et al., 2003; Piddock, 2006). L'expression de plusieurs pompes qui reconnaissent un meme substrat peut alors engendrer de tres hauts niveaux de resistance. Les systemes de pompes a efflux sont divises en 5 grandes families, dependant principalement du mecanisme d'expulsion, soit de l'energie utilisee, de leur specificite, mais aussi de la taille de ces proteines (Figure 5).
H* D r o8u e H" Amtaw W D r o8u e Drogue
glycosides
S amem £ coft" R aeruginosa L laais
MFS RNO ABC
Figure 5. Representation schematique de pompes a efflux (Schweizer, 2003).
Pour fonctionner, les pompes a efflux peuvent utiliser l'energie fournie par dissipation d'un gradient de protons (families MFS (superfamille des pompes majeures), RND (famille de resistance-nodulation-division cellulaire) et SMR (resistance multiple des staphylocoques)). Elles peuvent egalement utiliser l'energie fournie par les ions sodium
(famille MATE (expulsion de multi drogue et de composes toxiques)) ou encore par hydrolyse d'ATP (famille ABC transporteur) pour faire sortir les composes de la cellule (Figure 5). Les exemples de souches utilisant ce mecanisme pour resister aux composes antibiotiques sont tres nombreux (Tableau 3).
Tableau 3. Exemple de pompes a efflux retrouvees chez S. aureus et autres especes avec leurs substrats respectifs (Informations tirees de Grkovic et ah, 2002; Borges-Walmsley et al, 2003; Piddock, 2006)
Organisme Transporteur Substrat'
Famille MFS chez les bacteries a Gram Positif
Bacillus subtilis Bacillus subtilis Streptomyces coelicolor Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus TetL Bmr Mmr NorA QacA TetK TC AQ, BE, CP, FQ Methylenomicine AQ, BE, CP, FQ AQ, BE TC Famille MFS chez les bacteries a Gram Negatif
Echerichia coli Echerichia coli Pseudomonas aeruginosa Famille RND Echerichia coli Echerichia coli Heamophilus influenzae Pseudomonas aeruginosa Famille SMR Staphylococcus aureus
Bacterie a Gram negatif Famille ABC Transporteur
Staphylococcus aureus TetA EmrAB CmlA AcrB AcrD AcrB MexAB Smr QacE ArsB TC BE, CCCP, DNP, CP BE, Ery, SDS, TC Aminoglycosides BE, Ery, RP ? AQ, BE AQ, BE Arsenic
Les souches de S. aureus possedent des pompes a efflux, mais tres peu sont bien caracterisees. La plus connue, la pompe NorA, fait partie de la famille des pompes MFS et done, utilise la force proton motrice pour fonctionner (Figure 5). Cette pompe est entre autres responsable de la resistance a la norfloxacine et a d'autres fluoroquinolones (Tableau 3) mais, dans certains cas en cooperation avec d'autres mecanismes, confere egalement un phenotype de multi resistance. Cette pompe est retrouvee a la fois chez les souches sensibles et resistantes. Le gene codant pour cette pompe se trouve sur le chromosome des souches de S. aureus et possede une homologie de sequence avec les genes tet, genes responsables de la resistance a la tetracycline retrouves entre autres chez
E. coli. Chez les souches resistantes a la tetracycline le procede le plus reconnu et etudie
est la modification de la permeabilite cellulaire par l'utilisation des pompes a efflux (Tet) pour diminuer la concentration intracellulaire de l'antibiotique et permettre a la bacterie resistante de continuer la synthese proteique (Speer et al, 1992). Par contre, malgre sa similarite avec la pompe a efflux tet, l'activation de norA n'entraine pas de resistance a la tetracycline (Neyfakh, 1992). D'autre part, des mutants de S. aureus ayant une pompe NorA inactive, demontrent une sensibilite accrue a plusieurs composes antimicrobiens (Hsieh et al., 1998). De plus, il a ete demontre qu'une surexpression de NorA entraine un phenotype de multi-resistance et que des mutations presentes dans la region promotrice de cette pompe entrainent de hauts niveaux de resistance (Piddock, 2006).
L'autre pompe a efflux la plus etudiee chez S. aureus est QacA/EmrB. Les genes codant pour cette pompe sont situes sur un plasmide. Cette pompe exporte le bromure d'ethidium et autres composes en se servant de la force electrochimique de la membrane (Lewis, 1994). Cette pompe peut reconnaitre et exporter les composes antiseptiques, ce qui illustre bien le concept selon lequel les bacteries sont capables de se proteger contre une tres grande variete de molecules toxiques.
En plus d'utiliser les pompes a efflux pour resister aux antibiotiques, certaines especes sont dotees de mutations dans les genes codant pour les represseurs ou les regions
promotrices des pompes, ce qui entraine la derepression de celles-ci afm de les garder constamment en fonction et d'engendrer des niveaux de resistance tres eleves. Chez les souches tres resistantes de Pseudomonas aeruginosa, la derepression des pompes a efflux est souvent observee (Li et al. 1994). Aussi, l'equipe de Kaczmarek (2004) a demontre la presence de mutations dans la sequence du gene acrR, codant pour le represseur de la pompe a efflux AcrAB chez des souches A'Haemophilus influenzae tres resistantes. La resistance aux /3-lactamases chez les souches de E. coli est souvent associee a la surexpression d'ampC engendree par des mutations dans la region promotrice d'ampC (Tracz et al, 2005).
De meme, nous avons observe par etude transcriptomique une surexpression de plusieurs pompes a efflux (norA, arsB, qacA) chez les souches cliniques de SARM multiresistantes en comparaison avec les souches prototypes sensibles et resistantes. Ces modulations ont ete confirmees par PCR quantitatif, ce qui a egalement permis de verifier que ces pompes maintiennent cette surexpression dans le temps et ce, meme en l'absence de composes antibiotiques. Ces resultats evoquent la forte possibility d'une derepression de ces pompes a efflux chez les souches de SARM tres resistantes (Pruneau et al., soumis a International Journal of Medical Microbiology)
2.3 Aspects moleculaires de la resistance a la methicilline
Plusieurs souches de S. aureus ont developpe une resistance a la methicilline, la penicilline semi-synthetique introduite dans les annees 60 suite a l'apparition des souches resistantes a la penicilline. Ces souches resistantes a la methicilline, les SARM
(Staphylococcus aureus resistant a la methicilline) sont de plus en plus nombreuses et
causent des infections difficiles a traiter. Cette resistance est due a l'acquisition d'un element genetique particulier, la cassette mec.
2.3.1 Cassette mec (SCCmec)
La cassette mec, aussi appele SCCmec {Staphylococcal Cassette Chromosome mec) est un element genetique mobile, de 21 a 67 kb present uniquement chez les souches de
Staphylococcus aureus resistantes a la methicilline (Hiramatsu et al., 2001; Zhang et al.,
2005). Cet element confere la resistance a la methicilline par l'entremise du gene mecA present sur cet element qui code pour une PBP modifiee, la PBP2a qui possede une faible affinite pour les antibiotiques de type /3-lactamines. Outre le gene mecA, cet element possede dans certains cas, dependant du type de cassette, d'autres genes de resistance aux antibiotiques. Sa taille imposante laisse croire qu'il s'agit d'un ilot pathogenique mais l'element mec ne possede aucun gene de virulence (Hiramatsu et al., 2001). On retrouve egalement sur tous les types de cassettes les regulateurs de mecA, intacts ou tronques, soit
mecRl et mecl. II semble pourtant que la majorite des souches de S. aureus resistantes a
la methicilline aient un systeme mecI-mecR (situe en amont du gene mecA) non fonctionnel soit par deletion partielle de ces genes, soit par mutation ponctuelle. Le systeme blal-blaR (situe en amont du gene blaZ de la penicillinase) prend alors le controle du gene mecA et la transcription de ce gene devient inductible (Nour et al, 2005). La cassette mec porte egalement deux genes specifiques appeles ccrA et ccrB {cassette
chromosome recombinase A et B) qui codent pour une recombinase de la famille des
invertases (Hiramatsu et al., 2001). Ces recombinases reconnaissent les sequences repetees presentes aux extremites des cassettes mec qui leur sont specifiques. Ces genes sont responsables de l'excision et de l'integration de la cassette mec dans le chromosome et done, assurent sa mobilite (Hiramatsu et al, 2001).
La cassette mec est un element genetique mobile unique en son genre et son origine exacte est encore inconnue. On sait que cet element peut se propager entre les especes de staphylocoques, incluant S. aureus et S. epidermidis, mais jusqu'a aujourd'hui, aucun autre genre n'a ete rapporte comme etant porteur de cette cassette. L'elucidation de l'origine du gene mecA intrigue plusieurs chercheurs. Pour ce, les chercheurs tentent
d'identifier un genre bacterien portant la PBP2a de facon constitutive mais ces recherches n'ont donne aucun resultat valable. La PBP portee de facon intrinseque qui a le plus de similitude avec la PBP2a codee par le gene mecA a ete identifiee chez Staphylococcus
sciuri (87,8% d'identite) (Hiramatsu et al., 2001). Leurs domaines transpeptidase
possedent une similarite de 96% et celui de transglycosylase, 80% de similitude (Wu et
al., 1996). S. sciuri est une des plus ancestrales especes de staphylocoques et Ton
retrouve ces souches dans la flore normale des mammiferes inferieurs (Kloos et al., 1997). On retrouve occasionnellement cette espece chez 1'homme, mais sa presence n'est que tres rarement associee a des infections (Nagase et al., 2002) La majorite des souches de S. sciuri sont par contre sensibles a la methicilline (Couto et al., 1996). Ce gene homologue a mecA retrouve chez S. sciuri n'entraine done pas de resistance a la methicilline et sa fonction physiologique demeure d'ailleurs inconnue (Couto et al., 1996). L'hypothese soutenant que l'homologue de mecA retrouve chez S. sciuri serait un precurseur dans revolution vers le gene mecA des souches de S. aureus resistantes a la methicilline, a ete renforcee lorsque des souches de S. sciuri exposees a de fortes concentrations de methicilline ont reagi en activant l'homologue de mecA par des mutations ponctuelles dans la region promotrice de ce gene, entramant une resistance a la methicilline qui fut maintenue lorsque le gene a ete transpose aux souches de S. aureus prealablement sensibles (Wu et al., 2001).
La stabilite de la cassette mec semble etre influencee par des facteurs environnementaux. Des deletions spontanees au niveau du gene mecA ont ete observees chez des souches entreposees pour une longue periode dans un milieu sans antibiotique, dans une culture a haute temperature ou exposee a des rayons UV (Adhikari et al, 2004). Des etudes demontrent egalement qu'une haute temperature et un faible pH diminuen 1'expression de la resistance a la methicilline (Qoronfleh et al., 1998).
2.3.1.1 Variabilite des types de cassette mec
La variabilite des types de cassettes mec est importante pour comprendre 1'epidemiologic moleculaire des souches de SARM. Les cassettes mec sont actuellement classees par types, de I a V (Figure 6), dependant de la nature des complexes mec et ccr. Le type IV peut ensuite etre redivise, dependant de la variabilite dans les regions externes aux complexes mec er ccr. Ces sous-types sont nommes IVa, IVb, IVc, IVd (Zhang et al, 2005). II est possible de caracteriser le type de cassette mec pour une souche par sequencage de cette region ou encore par amplification specifique par PCR.
kdp III -T"^: >
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imecRI | cci2 | f msirti mm*. c mecl'RImccA C mocl/RI » » < * 0 pUBno g -D orfX II V IV cc/C AmecRI -f^h 11 > Am«cRI OTfX ( l S « I 10 kb I 1Figure 6. Polymorphisme des cassettes mec I a V presentes chez Staphylococcus aureus resistant a la methicilline (Tire de Deurenberg et al., 2005).
Les souches de SARM acquises en communaute (SARM-AC), portent preferentiellement le type IV de cassette mec. Cette predominance de la cassette mec de type IV chez les SARM-AC n'est pas encore expliquee mais apporte un autre indice suggerant qu'elles representent une toute nouvelle population, differente des souches retrouvees dans les
hopitaux. Par contre, le type IV de cassette mec est assez court (21 a 25 kb) en comparaison avec les autres types de cassette mec (34 a 67 kb) et se transmettrait done plus facilement. Ce type de cassette ne possede aucun gene de resistance autre que mecA (Okuma et al., 2002), ce qui correle bien avec le phenotype non multi-resistant des souches acquises en communaute, en comparaison avec le SARM retrouve en milieu hospitalier.
2.4 Aspects moleculaires de la resistance a la vancomycine
Les glycopeptides, dont la vancomycine, agissent en inhibant la synthese de la paroi cellulaire en se liant a la partie D-Ala-D-Ala du precurseur du peptidoglycane, ce qui nuit aux reactions de transpeptidation et transglycosylation impliquees dans la synthese de la paroi (Moreira et al., 1997; Sieradzki et al., 1999). Puisque la reaction de transpeptidation commence par une liaison a ce meme residu du precurseur, la resistance aux glycopeptides resulte entre autres d'une surproduction de peptidoglycane et de residus D-Ala-D-Ala (Moreira et al., 1997) (Section 3.4.1). Les etudes portant sur les souches resistantes a la vancomycine ont demontre des perturbations importantes au niveau de la paroi cellulaire de ces souches (Sieradzki et al., 1999). La plupart de ces souches presentent une paroi cellulaire plus epaisse que les souches sensibles (Moreira et al., 1997; Hanaki et al., 1998; Renzoni et al., 2006). II a ete suggere que chez les souches resistantes a la vancomycine, la paroi cellulaire plus epaisse offrirait plus de sites de liaison pour la vacomycine a l'exterieur de la cellule pour empecher son acces au site de transpeptidation pres de la membrane (Moreira et al, 1997; Renzoni et al, 2006) (Figure 7).
m
Cellule susceptible
m
o
o
i l l ° ° I I I ° tH °or ~ ° °o Glycopeptides
^ . i ^ ' T T
mi s ;„, »«.
Cellule resistante 8 Q 1 8 r 8 ^ 8 ° Glycopeptides 3 ft „ Q ° R « 8 8 c . . . o JniaHP1 J' «-m.S111I,1? b' °q u e s ,iiiii"" c $ > " "xs Precurseur de la synthese de la paroi celtulaire avec residu D-Ala-D-Ala
^ ^ Glycopeptide
oo Terminaison D-Ala-D-Ala (non assemble) paroi cellulaire-peptidoglycan
° Terminaison D-Ala (assemble) paroi cellulaire-peptidoglycan
Figure 7. Representation du modele propose pour la resistance aux glycopeptides chez S.
aureus (Modifie de Sieradzki et al., 1999).
La vancomycine est l'antibiotique de choix utilise pour combattre les infections causees par les souches de S. aureus multi-resistantes. II est souvent reconnu comme etant l'antibiotique de dernier recours (Sieradzki et al., 1999). La resistance a cet antibiotique s'est recemment developpee chez les souches de S. aureus, ce qui laisse tres peu d'options pour le traitement des infections au SARM multi-resistant. La resistance a la vancomycine est plus repandue et mieux connue chez les souches d'enterocoques. Chez ces souches, les genes van sont responsables de la resistance. L'operon van code pour une enzyme qui hydrolyse D-Ala-D-Ala, le site de liaison de la vancomycine, et une autre proteine qui fait la synthese du D-Ala-D-Lactate qui entrera dans la composition du
precurseur de peptidoglycane. L'affinite de la vancomycine pour le D-Ala-D-Lactate est diminuee de 1000 fois en comparaison avec la structure normale, ce qui ne permet plus la liaison de la vancomycine et donne un tres haut niveau de resistance (Weigel et al., 2003; Courvalin, 2006). Malheureusement, l'operon van a ete retrouve recemment chez des souches cliniques de S. aureus (Severin et al., 2004) et il ne faudra peut-etre maintenant que quelques annees pour que cette resistance de haut niveau et transferable ne se retrouve chez la majorite des souches cliniques.
CHAPITRE 3. STAPHYLOCOCCUS AUREUS RESISTANT A LA METHICILLINE (SARM)
3.1 Evolution et adaptation du SARM
La capacite de Staphylococcus aureus de s'adapter aux traitements qui lui ont ete imposes et de dejouer aisement les modes d'action de la plupart des antibiotiques est un phenomene impressionnant. (Figure 8).
1940 1960 1980 2000
1941-Introduction de la penicilline pour traiter les
infections
1 T
1960 - Introduction de nouvelles drogues stables
aux (3-lactamases pour combattre les infections
(methicilline ) 1944-Apparition de souches resistantes a la penicilline par production de p-lactamases 1975- Emergence de souches resistantes a la methicilline (SARM) 2003- Apparition de SARM dans la communaute (SARM-AC) 2001 - Apparition au Japon de souches de S. aureus resistantes a la vancomycine (SARM-VanR)
Figure 8. Representation schematique de revolution de la resistance aux antibiotiques dans le temps chez S. aureus.
En 1941, on introduit la penicilline, un antibiotique de type /3-lactamine (Section 2.1), pour combattre les infections causees par S. aureus. Trois ans plus tard, on note
1'apparition de souches resistantes a la penicilline (Neu, 1992). Ces souches resistantes possedent l'operon bla, portant le gene blaZ qui code pour une /3-lactamase, enzyme qui hydrolyse et inactive la penicilline (Figure 4). Aujourd'hui, une tres grande majorite des souches de S. aureus sont resistantes a la penicilline. Aux Etats-Unis, plus de 90 % des souches de S. aureus seraient resistantes a la penicilline et a d'autres antibiotiques de la famille des /3-lactamines (Agence de sante publique du Canada, 1999). La necessite de decouvrir un antibiotique stable en presence de /3-lactamases se fait done sentir et, en 1960, on introduit alors une penicilline semi-synthetique capable de dejouer les /3-lactamases, la methicilline. Cette nouvelle molecule contient le cycle caracteristique des /3-lactamines, mais sa structure differe au niveau de sa chaine laterale. Le traitement avec la methicilline reussit a controler les infections a S. aureus pendant 15 ans. En 1975 emergent les premieres souches de S. aureus resistantes a la methicillline, communement appelees SARM. Depuis, la prevalence de ces souches augmente constamment et plusieurs de ces souches deviennent multi-resistantes, e'est a dire resistantes a plusieurs classes d'antibiotiques, autres que les /3-lactamines. Le SARM est aujourd'hui l'un des principaux agents causals des infections dans les hopitaux. (Kuklin et al., 2006). En 1997, on voit emerger au Japon des souches de SARM avec un niveau de resistance intermediate a la vancomycine, 1'antibiotique qui occupe la premiere place lors du choix de traitement pour les infections au SARM . En 2001, les veritables souches resistantes a la vancomycine (SARM-VR) ont emerge (Weigel et al., 2003; Tiwari et al., 2006). II devient alors tres problematique de traiter les infections aux SARM. Tout recemment, des souches de SARM ont ete retrouvees dans la communaute (SARM-AC) causant des infections chez des individus ne presentant aucun facteur de risque (Section 3.1.1).
Depuis son apparition, la prevalence du SARM ne cesse d'augmenter. Au Canada, une etude sur l'incidence de SARM dans les hopitaux canadiens demontre que le taux de portage est passe de 0,46 cas pour 1000 admissions a 5,10 pour 1000 admissions de 1995
au Canada atteint done aujourd'hui environ 50% alors qu'aux Etats-Unis, on evalue a 60% la proportion des souches qui sont resistantes a la methicilline dans les infections nosocomiales causees par S. aureus et cette proportion tend a augmenter (Rice et al., 2006). En Chine et au Japon, la proportion de souches resistantes est maintenant superieure a 80%.
Bien qu'il existe une importante diversite genetique de SARM, la caracterisation moleculaire par electrophorese en champs pulses demontre qu'il existe un nombre relativement restreint de clones epidemiques en circulation dans les hopitaux canadiens, soit 6 clones principaux selon les etudes de Simor et al. (2002). De ces six clones, l'agence de sante publique du Canada en repertorie 4 comme clones epidemiques qui sont classes suivant la nomenclature suivante : SARMC1 (Souche SARM Canadienne 1), SARMC 2, etc. Le clone SARMC2 est considere comme la plus repandue des souches canadiennes actuelles, meme si les souches SARMC 1 et SARMC 3 se rencontrent bien plus frequemment dans certaines regions du Canada (Agence de sante publique du Canada, 1999).
3.1.1 Resistance et virulence des SARM
Depuis 1'emergence des souches de SARM, celles-ci se sont retrouvees exposees a plusieurs antibiotiques et la majorite des souches ont trouve le moyen de dejouer ces nouveaux antibiotiques. En effet, la plupart des souches de SARM retrouvees dans les hopitaux sont multi-resistantes (SARM-MR), resistant a plusieurs classes d'antibiotiques en plus des /3-lactamines (Fey et ah, 2003). Au Canada par exemple, l'etude de l'Agence de sante publique du Canada a demontre que sur environ 4000 souches, toutes etaient resistantes aux /3-lactamines alors que les taux de resistance aux autres agents antimicrobiens etaient les suivants: erythromycine (94%), clindamycine (85%), ciprofloxacine (90%), trimethoprime-sulfamethoxazole (46%), tetracycline (28%), acide
fusidique (6%), mupirocine (4%), rifampicine (2%) mais aucune ne presentait une sensibilite reduite a la vancomycine (Rapport de l'agence de sante publique du Canada, 2005). Par contre, il existe des souches de SARM resistantes a la vancomycine (SARM VR), antibiotique qui est habituellement utilise pour traiter les infections au SARM. Les premieres souches possedant une resistance intermediate ont emerge au Japon en 1997 (Weigel et al., 2003; Tiwari et al, 2006). Peu de temps apres, d'autres souches resistantes intermediaries ont emerge dans le monde. C'est en 2001 que la premiere souche resistante a la vancomycine a ete rapportee, aux Etats-Unis (Weigel et al., 2003; Tiwari et
al., 2006). Ces souches possedent done des niveaux de resistance tres eleves. L'etude de
ces souches a permis de demontrer que la virulence des souches resistantes a la vancomycine etait differente de celle retrouvee chez les souches sensibles. En effet, les souches de SARM-VR presentent entre autre des taux de croissance ralentis (Finan et al., 2001; Mongodin et al, 2003) ainsi qu'un systeme agr souvent inactif (Sakoulas et al., 2002).
D'autre part, les souches retrouvees en communaute (SARM-AC) presentent un profil de resistance aux antibiotiques completement different: ces souches sont uniquement resistantes aux /3-lactamines (Okuma et al., 2002; Fey et al., 2003). De plus, les souches SARM-AC presentent des patrons limites au typage par electrophorese en champs pulses contrairement au SARM hospitalier (SARM-H) dont les clones epidemiologiques sont diversifies (Simor et al., 2002; Fey et al., 2003). Au niveau de la virulence, il a ete demontre que ces souches se multiplient beaucoup plus rapidement que le SARM retrouve en milieu hospitalier (Okuma et al., 2002) (Tableau 4).
Tableau 4. Caracteristiques des souches de SARM acquises en communaute et en milieu hospitalier (Informations tirees de Chambers, 2001; Simor et al, 2002; Okuma
et al, 2002; Fey et al, 2003; Vandenesch et al, 2003).
Virulence Diversite Resistance Facteurs de risque SARM-AC Elevee Tres grande SARM-HO Plus faible Faible
Comme les souches sensibles sauf pour les /3-lactamines.Rares
exceptions de resistance aux antibiotiques non-0-lactamines
Multiples classes d'antibiotiques (Multi-Resistant) • /3-lactamines
• Quinolones • Macrolides • Aminosides
Quelques souches resistantes a la vancomycine
Aucun Hopital, Maladie, Age
Les souches de SARM acquises en communaute (SARM-AC) tiennent leur nom du fait qu'elles ont ete detectees dans la communaute chez des personnes n'ayant aucun facteur de risque tel qu'une hospitalisation recente ou encore un affaiblissement du systeme immunitaire par la maladie ou encore par l'age du porteur. La prevalence exacte de ces souches reste inconnue puisqu'il n'existe pas de systemes de surveillance pour les detecter (Chambers, 2001).
La provenance exacte des souches retrouvees en communaute est encore ambiguee. On ignore s'il s'agit de souches qui ont une origine commune avec le SARM retrouve dans les hopitaux ou s'il s'agit d'une eclosion completement differente (Okuma et al, 2002). Plusieurs hypotheses ont ete emises pour expliquer l'origine de ces souches, mais aucune n'a encore ete confirmee. La premiere possibilite serait que ces souches auraient devie du milieu hospitalier mais auraient subi des changements considerables puisque leur patron obtenu en champs pulses ainsi que leur susceptibilite aux antibiotiques sont completement differents des souches en milieu hospitalier (Chambers, 2001; Vandenesch,
communaute soient apparues suite a l'acquisition de l'element conferant la resistance a la methicilline, soit l'element mec, mais chez des souches ayant des antecedents genetiques de susceptibilite. Cette hypothese expliquerait les differents patrons de typage moleculaire et le niveau de resistance a une seule classe d'antibiotiques. Pour les souches resistantes a la penicilline retrouvees en communaute, on suspecte la dissemination de souches des hopitaux ou encore le transfert horizontal du gene pour la penicillinase. Par contre, l'element codant pour la penicillinase est retrouve sur un plasmide contrairement a l'element mec qui est chromosomique et done, le transfert de l'element mec est plus rare.
3.2 Phenotypes de Staphylococcus aureus resistant a la methicilline
La production de PBP2a n'amene pas la population entiere a exprimer la meme resistance, mais plutot un melange de cellules qui possedent differents niveaux de resistance (resistance heterogene). On distingue en fait deux categories principales de phenotypes de resistance chez les souches resistantes a la methicilline (Figure 9). Tout d'abord les souches homogenes (homotypiques) qui expriment habituellement de hauts niveaux de resistance et les souches heterogenes (heterotypiques) qui expriment de plus bas niveaux de resistance, bien que des souches hautement resistantes puissent etre presentes. Une population exprimant une resistance homogene se developpe souvent suite a une exposition prolongee a l'antibiotique. On peut egalement distinguer un autre phenotype de resistance, soit les PRE-MRSA, qui possede le gene mecA, mais ou son represseur, Mecl est tres actif et confere a la souche une susceptibilite fragile a la methicilline (Kondo et al., 2001). La resistance chez ces souches apparait lorsqu'il y a inactivation de Mecl, laissant alors place a une population heterogene. Un dernier phenotype a egalement ete rapporte, appele « Eagle-type», qui est caracterise par une resistance a de hautes concentrations de methicilline (64 a 512 ug/ml) et une susceptibilite a de faibles concentrations (2 a 16 ^.g/ml) (Kondo et al., 2001). Les
alterations genomiques responsables de ce dernier phenotype seraient comparables a ceux permettant la conversion d'une population heterotypique a homotypique.
Hetero-type
Concentration de methicilline (ug/ml)
0 2 8 32 128 512 2048 Concentration de methicilline (ug/ml)
Figure 9. Phenotypes de resistance a la methicilline presents chez S. aureus (Figure tiree
deKondo etal., 2001).
3.3 Susceptibilite a l'autolyse et a la lysostaphine
Lorsque exposees aux antibiotiques de type /3-lactamines, les souches susceptibles de S.
aureus vont repondre par une diminution de leur croissance, suivie d'une lyse et de la
mort cellulaire. Lorsque la croissance bacterienne est possible en presence de methicilline, elle mene a un mauvais assemblage du peptidoglycane ainsi qu'a une susceptibilite accrue a l'autolyse (Qoronfleh et al., 1986). Les souches de SARM peuvent done repondre differemment a 1'exposition aux antibiotiques en modifiant leur taux
d'autolyse en comparaison avec les souches sensibles. L'etude de la capacite autolytique des souches resistantes est importante pour comprendre son implication possible dans la resistance. Les recherches indiquent que l'autolyse des souches resistantes est differente de celle des souches sensibles. L'equipe de Seligman (Seligman, 1970) a demontre que les souches de SARM avaient une activite autolytique superieure a celle des souches sensibles. II semble que la capacite de lyse differerait egalement entre les souches resistantes selon leurs phenotypes de resistance, qu'elles soient homo genes ou heterogenes. Les observations de Qoronfleh, M.W et al. (1986), suggerent que la resistance heterogene et associee avec une activite autolytique superieure. D'un autre cote, Smith et Wilkinson (1981) ont note que les souches avec une resistance homogene n'etaient pas lysees lorsqu'exposees a de fortes concentrations de methicilline (Smith et
al, 1981).
D'autre part, des souches resistantes a la vancomycine creees en laboratoire ont demontre des caracteristiques interessantes. Ces souches presentent une susceptibilite a l'autolyse reduite, un taux de croissance plus lent ainsi qu'une paroi cellulaire plus epaisse que chez les souches sensibles (Hanaki et al, 1998; Boyle-Vavra et al., 2001; Weigel et al, 2003; Renzoni et al., 2006; Tiwari et al., 2006). En plus de ces caracteristiques, certains mutants ont ete decrits comme etant egalement moins susceptibles a la lysostaphine (Moreira et al, 1997).
La lysostaphine est une endopeptidase qui mene a la lyse cellulaire et possede une activite specifique dirigee contre les staphylocoques (Huber et Huber,1989; Climo et al, 2001; Kusuma et al, 2005). Pour cette raison, la lysostaphine a ete etudiee pour sa capacite antimicrobienne. La plupart de ces recherches ont conclu qu'il serait difficile d'utiliser la lysostaphine comme traitement contre les infections a S. aureus puisqu'il est ardu d'obtenir une preparation pure de lysostaphine et qu'on ne connait pas son potentiel
