Le western-blot permet de séparer les protéines selon leur poids moléculaire. La plupart des protéines étudiées dans le cadre de cette thèse ont un faible poids moléculaire essentiellement compris entre 43 et 65 kDa.
Ensuite 50 µg de protéines sont déposées sur un gel d’électrophorèse (TGX Stain Free™ FastCast™ Acrylamide kit 12%). Ces gels ont la particularité de contenir des composants trihalogénés qui peuvent former des liaisons covalentes avec les résidus tryptophane des protéines présentes dans les échantillons biologiques lors d’une exposition aux ultratviolets (UVs), et induisent ainsi une émission de fluorescence.
Le gel d’électrophorèse s’effectue en deux parties afin de pallier aux problèmes liés aux faibles quantités de protéines déposées dans les puits. On effectue donc une étape de concentration jusqu’à l’obtention de zones protéiques très fines dans le gel de concentration (4% d’acrylamide) puis une étape de migration dans le gel de séparation (12% d’acrylamide). La migration des protéines s’effectue par électrophorèse durant une heure à 200 V dans un tampon de migration contenant 25 mM Tris, 192 mM de glycine et 0,01% Sodium-Dodécyl- Sulfate. Une fois la migration des protéines terminée, le gel est récupéré dans son tampon de migration et est activé aux UVs via le ChemiDoc™ MP System ou G-Box Syngene afin de mettre en évidence les smears de protéines.
Par la suite, le transfert des protéines est réalisé en mode semi-sec (kit Turbo TransBlot, BioRad®) selon le programme (1,3 A ; 25 V ; 7 minutes). Pour le transfert, les éléments suivants sont déposés dans l’ordre dans une cassette : un papier Whatman, une membrane PVDF (Polyvinylidène Difluoride) le gel et un deuxième papier Whatman. Chaque élément
est préalablement imbibé dans du tampon de transfert. La membrane est ensuite saturée pendant 45 minutes dans du TBS-Tween 0,05% contenant 3% de lait écrémé Régilait® à température ambiante.
Après cette étape de saturation, la membrane est incubée avec les AC I dilués dans du TBS- Tween 0,05%-lait 3% durant toute la nuit à 4°C sous agitation en chambre froide
(Tableau 8).
Anticorps primaire Lot et fournisseur Dilution Anticorps secondaire Lot et fournisseur Dilution Connexine 43 (lapin)
Lot SAB4300504
SIGMA 1/500ème
Chèvre anti lapin couplé à
l’HRP BioRad 1/2000ème
KV7.1 (lapin)
Lot APC022AN0925
Alomone 1/400ème
Chèvre anti lapin couplé à
l’HRP BioRad 1/2000ème
KV4.3 (lapin)
Lot 2355319
Millipore 1/200ème
Chèvre anti lapin couplé à
l’HRP BioRad 1/2000ème
Tableau 8. Liste des anticorps primaires et secondaires utilisés pour le Western-Blot.
Le lendemain après 2 lavages de 10 minutes dans du TBS-Tween 0,05%, la membrane est incubée avec les AC II appropriés couplés à l’HRP pendant 2 heures à température ambiante. Après 2 lavages de 10 minutes, la membrane est placée dans le ChemiDoc™ MP System ou G-Box Syngene afin de quantifier la totalité des protéines hybridées avant la révélation. Cette étape permet de quantifier la quantité de protéine déposée, généralement contrôlée par la mesure de la quantité de protéine de référence (β-actine, GADPH…). Ensuite la membrane est révélée par la méthode ECL à l’aide du kit Thermo Scientific contenant un substrat chimiluminescent de la peroxydase. Les protéines d’intérêt sont détectées par chimiluminescence grâce au ChemiDoc™ MP System ou G-Box Syngene. L’analyse des résultats est effectuée à partir du logiciel Image J®
. La quantification de l’intensité de chaque bande spécifique et l’intensité totale de chaque ligne est réalisée afin de déterminer les protéines totales et ainsi normaliser les valeurs d’intensité des bandes spécifiques.
IX/ Tests statistiques
Les résultats obtenus sont exprimés en moyenne ± écart type. Chaque expérience est répétée plusieurs fois avec n correspondant au nombre de cellules testées pour chaque groupe cellulaire et N au nombre de cœurs de cochons.
L’outil mathématique utilisé afin de déterminer la significativité statistique des différences entre nos échantillons est le test de Student. Il permet de comparer deux groupes lorsque les variances sont égales. Dans le cas où l’égalité des variances entre les deux groupes est différente, un test non paramétrique : le test de Mann-Whitney est employé.
Lors de la comparaison de paramètres issus de deux régions d’une même préparation ventriculaire, des tests appariés sont effectués.
Pour l’analyse des résultats obtenus en cellulaire, une analyse de variance (ANOVA) à un facteur est réalisée.
La corrélation de différents paramètres est testée par régression linéaire.
Les différences sont considérées comme statistiquement significatives lorsque la probabilité d’erreur P est inférieure à 0,05 (*) ; à 0,01 (**) et 0,001 (***).
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Cette partie « Résultats et discussion » de ce manuscrit expose les données expérimentales obtenues durant cette thèse et s’articule autour de deux études.
La première étude traitant de la caractérisation électrophysiologique et structurelle de l’infundibulum pulmonaire n’a pas été encore soumise pour publication et sera donc présentée sous forme de résultats préliminaires.
Par la suite, les travaux menés sur le remodelage électrophysiologique et structurel du VD et VG dans un modèle porcin de tétralogie de Fallot réparée seront présentés sous forme d’articles scientifiques soumis :
- Pro-Arrhythmic remodeling of the right ventricle in a porcine model of repaired tetralogy of Fallot
- Arrhythmogenic remodeling of the left ventricle in a porcine model of repaired tetralogy of Fallot
Ils seront complétés de résultats supplémentaires n’ayant pas encore fait l’objet d’une publication.
En parallèle de cette deuxième étude, nous avons pu contribuer à une caractérisation sur le plan génétique du modèle porcin utilisé dont les résultats furent publiés dans le journal scientifique PlosOne sous le titre de :
Identification of region-specific myocardial gene expression patterns in a chronic swine model of repaired Tetralogy of Fallot (cf. Annexe 1).
Première étude : Hétérogénéité des propriétés de conduction et de repolarisation au sein du
ventricule droit de cochon
I/ Contexte et objectifs
L’origine embryologique distincte entre le VD et le VG confère une identité propre à chaque ventricule sur le plan électrophysiologique (Boukens et al., 2009). Ainsi, les variations concernant le profil d’expression de gènes codant pour certains canaux ioniques ou d’autres protéines comme les connexines, sont responsables au sein des ventricules de l’hétérogénéité des propriétés électrophysiologiques (Watanabe et al., 1983). Par exemple, l’activation ventriculaire se termine dans le VD et celui-ci possède également des APDs
courts par rapport au VG (Arteyeva et al., 2015). Il existe aussi des disparités structurelles entre le VD et le VG comme une rotation différente des fibres myocardiques (Haddad et al.,
2008b).
De plus, il y a au sein même de la cavité ventriculaire droite, des différences sur le plan anatomique et embryologique entre l’infundibulum pulmonaire et le reste du VD. Ainsi, le RVOT se met en place tardivement lors du développement embryonnaire puisqu’il apparaît lors de la septation du cono-troncus vers le 45ème jour de vie intra-utérine. Il se présente sous une forme conique et il s’étend de la crista supraventricularis à la valvule pulmonaire. Sa maturation est beaucoup plus lente que celle du VD. En effet, durant le stade embryonnaire, le RVOT possède de faibles propriétés contractiles et des propriétés de conductions lentes liées à l’absence de la Cx43 (Moorman and Christoffels, 2003).
A l’âge adulte, l’infundibulum pulmonaire exprime en faible proportion les gènes Gjα1 et
SCN5A codant respectivement pour la protéine Cx43 et le canal Nav1.5, garantissant une VC
lente au sein du RVOT par rapport à la paroi libre du VD (Boukens et al., 2013). L’expression hétérogène du canal Nav1.5 et de la Cx43 conduit à des différences régionales des VC au sein
de la cavité ventriculaire droite, rendant le VD plus vulnérable aux troubles de conduction et aux arythmies. En effet, la majorité des tachycardies idiopathiques proviennent de la région RVOT, et ce dernier est impliqué dans l’arythmogénicité de nombreuses pathologies telles que le syndrome de Brugada, la DAVD, et l’ICD.
Nous avons donc souhaité caractériser les propriétés électrophysiologiques et structurelles du VD et plus particulièrement de l’infundibulum pulmonaire ou RVOT sur l’animal sain.