La mesure du Ca2+ est possible grâce au dispositif de microspectrofluorimétrie décrit dans la Figure 59. Les cardiomyocytes sont placés dans une chambre expérimentale sur un microscope inversé à épifluorescence (Nikon Eclipse Ti-U) et sont observés grâce à un objectif X40. Les cellules sont perfusées de manière continue (1 mL/min) avec une solution de Tyrode contenant (en mM) : 137 NaCl ; 5,4 KCl ; 0,33 NaH2PO4 ; 0,5 MgCl2 ; 6H2O ; 5
HEPES ; 5,6 Glucose ; 1.8 CaCl2 avec un pH ajusté à 7,4 par le NaOH. La température de la
Microcontrols) à 37°C. Les cardiomyocytes sont stimulés par deux électrodes de platine de part et d’autre de la chambre expérimentale créant un champ électrique. L’amplitude des stimulations est comprise entre 60 et 90 V avec une durée des pulses de 1 à 5 ms. La fréquence de stimulation des cardiomyocytes est de 1 Hz. La mesure du Ca2+ se fait simultanément à celle de la longueur des sarcomères.
Contrôleur de température Stimulateur Objectif X40 Chambre expérimentale Perf usion de la chambre (Tyrode) Perfusion d’agents pharmacologiques
Stylet chauf f ant
Monochromateur Lampe au Xenon PMT Miroir dichroïque (400 nm) Miroir dichroïque (600 nm) Filtre passe bande
510 20 nm Miroir oscillant Caméra Acquisition inf ormatique Lumière blanche Filtre rouge
Figure 59. Dispositif expérimental pour la mesure de la fluorescence du Fura-2 et de la contraction cellulaire. Les cardiomyocytes sédimentent dans une chambre expérimentale par gravité perfusée par une solution de Tyrode maintenue à 37°C. Les cellules sont observées grâce à un objectif X40. Elles sont soumises à un champ électrique contrôlé par le boitier de stimulation. La longueur des sarcomères des cellules est suivie par logiciel sur l’image provenant de la caméra. La lampe Xénon et le miroir oscillant sont utilisés pour produire la lumière d’excitation à 340 nm et 380 nm afin d’exciter le Fura-2. La fluorescence émise par le Fura-2 est collectée à 510 nm par un photomultiplicateur (PMT). La perfusion rapide d’agents pharmacologiques peut être réalisée à proximité immédiate de la cellule grâce au stylet chauffant.
a) Mesure des transitoires calciques
Les cardiomyocytes sont incubés dans une solution tampon HEPES de 0,75 mM de CaCl2, contenant 3 µM de la sonde Fura-2AM (Invitrogen) pendant 10 minutes à
compartimentalisation de la sonde. Les cellules sont ensuite centrifugées 1 minute à 800 rpm, puis elles sont resuspendues dans le tampon HEPES avec 0,75 mM de CaCl2. Les
cardiomyocytes sont incubés 15 min à 37°C afin de permettre la désestérification de la sonde
(Figure 58B). Ensuite les cardiomyocytes chargés en Fura-2 sont placés dans la chambre
expérimentale à l’obscurité afin d’éviter le photo-blanchiment de la sonde.
Les cellules sont illuminées par une lumière rouge produite par une lampe halogène 100 W et filtrée par un filtre passe haut de 610 nm.
La lumière d’excitation provient du monochromateur (CAIRN Research) couplé à une lampe Xenon de 150 W. Les cardiomyocytes sont soumis à une double excitation lumineuse à la longueur d’onde de 340 nm (spécifique de la sonde liée au Ca2+
) et de 380 nm (spécifique de la sonde libre en Ca2+). La fluorescence émise par la sonde est séparée de la lumière d’excitation par un premier miroir dichroïque à 400 nm puis par un second miroir dichroïque à 600 nm. Les longueurs d’onde supérieures à 600 nm sont collectées par une caméra vidéo afin de visualiser les cellules sur l’ordinateur. Par contre, les longueurs d’onde inférieures à 600 nm passent au travers d’un filtre passe bande de 510 ± 20 nm permettant de sélectionner la lumière émise par la sonde Fura-2. La fluorescence émise par la sonde pour chaque longueur d’onde d’excitation est collectée par le tube photomultiplicateur (PMT) puis moyennée par le module de spectrophotométrie intégré au monochromateur. L’acquisition des signaux fluorescents se fait par le logiciel IonWizard (IonOptix) qui permet également de calculer le rapport de fluorescence Rfluo = F340/F380.
b) Mesure du raccourcissement des sarcomères
La mesure du raccourcissement des sarcomères est réalisée simultanément à la mesure du Ca2+ intracellulaire. Elle s’effectue grâce à une caméra CCD connectée au port latéral du microscope (Figure 59). Le système est préalablement calibré à l’aide d’un micromètre. La longueur des sarcomères est suivie en continu lors de la contraction de cardiomyocytes isolés grâce au logiciel IonWizard (IonOptix).
Le principe de cette mesure consiste à analyser l’espacement moyen entre les lignes Z de la cellule isolée sur l’image de la caméra par une transformée de Fourier appliquée sur une fenêtre spatiale définie par l’utilisateur. La fréquence spatiale dominante correspond à la longueur moyenne des sarcomères sur la fenêtre spatiale définie.
3. Analyses des données
a) Mesure du calcium intracellulaire par spectrofluorimétrie
L’analyse des transitoires calciques consiste à déterminer le niveau diastolique et systolique en Ca2+ afin d’évaluer l’amplitude ([Ca2+]systolique - [Ca2+]diastolique). De plus, la
cinétique des transitoires est analysée avec notamment le temps pour arriver au pic systolique de Ca2+ ainsi que la constante de temps de décours du transitoire calcique (Tau Transitoire Ca2+) (Figure 60B). Data 1 26 27 28 29 1.82 1.84 1.86 Legend 2 µm Data 1 32 33 34 35 0.95 0.96 0.97 0,01 a.u. Amplitude Amplitude Pic systolique Niveau diastolique 1 s Longueur diastolique Ƭ Ƭ Raccourcissement cellulaire A Calcium intracellulaire B Tpic Tpic
Figure 60. Analyse des paramètres contractiles et des transitoires calciques. Représentation de tracés
montrant le raccourcissement d’un sarcomère (A) et le transitoire calcique associé (B) ainsi que les paramètres mesurés. Les tracés rouges reproduisent le fit exponentiel utilisé pour déterminer la constante de temps Tau (τ).
b) Mesure du raccourcissement des sarcomères
Le suivi de la longueur des sarcomères (LS) a permis d’analyser les longueurs diastoliques et systoliques, et ainsi de déterminer l’amplitude du raccourcissement des sarcomères (longueurdiastolique - longueursystolique). Au niveau des cinétiques, le temps pour
atteindre le pic systolique et la constante de temps de relaxation (Tau relaxation) sont également mesurés (Figure 60A).