a) Fixation
Différents échantillons de myocarde d’une dimension de 1,5 x 1,5 cm sont prélevés en doublon sur chaque cœur d’animaux. Les prélèvements sont d’origines distinctes : VG antérieur, VD, RVOT. Ces échantillons sont ensuite fixés de façon chimique dans une solution tampon phosphate salin (PBS, Phosphate-buffered saline) 1X supplémentée de 4% de paraformaldéhyde (PFA) durant une semaine à 4°C sous agitation.
Après la fixation du tissu, les échantillons sont rincés plusieurs fois dans du PBS 1X.
b) Déshydratation-imprégnation
La déshydratation et l’imprégnation du tissu sont effectuées au moyen de l’automate Leica®
TP 1020 suivant le protocole : - 1 bain éthanol (ETOH) 70 % (5 minutes) - 3 bains ETOH 95% (1 heure/bain)
- 3 bains ETOH 100% (1h30 pour les 2 premiers bains et 1h30 pour le dernier) - 3 bains toluène (1 heure/bain)
- 2 bains paraffine (1 heure/bain)
La déshydratation va permettre d’éliminer l’eau tissulaire au moyen de bains d’ETOH successifs et le toluène favorise l’imprégnation de la paraffine dans le tissu.
c) Inclusion-coupe
Chaque échantillon est positionné dans une cassette selon une orientation déterminée : un échantillon dans le sens (1) longitudinal et son doublon dans le sens (2) transversal afin d’obtenir les fibres cardiaques dans le petit et le grand axe (Figure 61).
Epicarde Epicarde
(1) (2)
Sens de coupe Sens de coupe
Figure 61. Représentation schématique de l'orientation des blocs de tissu lors de l'inclusion. Les blocs de
tissu sont inclus dans le sens longitudinal (1) et dans le sens transversal (2).
Par la suite, les cassettes sont remplies de paraffine fondue sur une plaque à 4°C durant une heure afin que les blocs constitués se durcissent. Les échantillons sont ensuite conservés à -20°C.
Des coupes de 8 µm sont réalisées à l’aide d’un microtome Leica®
RM 2255 à partir des blocs de tissu. Les coupes sont placées dans un bain marie à 37°C et délicatement étalées sur lames.
d) Coloration
Après séchage des lames sur plaque chauffante pendant au moins deux heures, les lames sont colorées au Trichrome de Masson et à l’Hémalun. Le Trichrome de Masson colore les fibres de collagène en vert/bleu, l’Hémalun colore les noyaux en violet et la Fuchsine Ponceau colore les myocytes en rouge.
Cette coloration est effectuée grâce au Teinturier HMS 70 selon le protocole suivant
Bains Temps
Déparaffinage Toluène 5 min
Toluène 5 min
Hydratation
Alcool 100% 5 min
Alcool 95% 4 min
Alcool 80% 5 min
Eau du robinet 4 min
Coloration
Hémalun 5 min
Eau milliQ 5 min
Fuchsine Ponceau 1% 1 min
Acide phosphomolybdique 3% 1 min
Eau acétifiée 1% 1 min
Vert lumière 1% 2 min
Eau acétifiée 1% 1 min
Déshydratation ETOH 95% 3 min ETOH 95% 3 min ETOH 100% 3 min ETOH100% 3 min Toluène 3 min
Tableau 4. Tableau synthétisant le protocole utilisé pour la procédure de coloration au teinturier HMS70.
L’observation des coupes transversales et longitudinales des blocs de tissu est réalisée avec un microscope Nikon®eclipse 80i à l’objectif X10 et X40 couplé à une caméra CCD raccordée à un ordinateur équipé du logiciel NIS Elements3.2.
e) Quantification de la fibrose
La quantification de la fibrose est réalisée par le logiciel ImageJ®. Chaque image est soumise à un ajustement des seuils de reconnaissance des couleurs pour mettre en évidence et quantifier la couleur spécifique au collagène (vert lumière), laissant ainsi les zones de fibrose représentées en noir. Le signal positif (noir) est ensuite quantifié et exprimé en pourcentage de la superficie totale de la coupe.
2. Immunocytochimie
a) Principe
Cette technique permet de détecter et de localiser une protéine au niveau cellulaire ou tissulaire. Le marquage de la protéine d’intérêt peut être direct ou indirect.
L’immunomarquage direct nécessite un anticorps primaire couplé à un traceur (fluorophore ou enzyme). Le marquage indirect de la protéine d’intérêt nécessite l’utilisation d’anticorps primaires (AC I) puis d’anticorps secondaires (AC II) couplés à un fluorochrome ou une enzyme dirigés contre les AC I. Le marquage indirect peut être mis en évidence par fluorescence (utilisation de fluorochrome) ou par activité enzymatique (utilisation d’enzyme et de substrat) (Figure 62).
Protéine
Antigène de la protéine cible Anticorps primaire Antigène de l’anticorpsprimaire Anticorps secondaire
Fluorochrome Excitation Emission
Figure 62. Principe de l'immunomarquage indirect. L’anticorps primaire (AC I) se fixe sur l’épitope de la
protéine d’intérêt. L’anticorps secondaire (AC II) dirigé contre l’AC I est couplé à un fluorochrome. Après excitation à une longueur d’onde spécifique au fluorochrome, on observe une émission de fluorescence au niveau des protéines d’intérêt.
Il existe des procédés permettant d’amplifier le signal grâce à l’utilisation de complexe avidine-biotine. (Figure 63).
3 Amino 9 ethyl carbazole Anticorps secondaire biotinylé Streptavidine AEC Chromogène :
Protéine
Antigène de la protéine cible Anticorps primaire PeroxydaseFigure 63. Principe de l'immunomarquage indirect amplifié par la streptavidine-biotine. L’AC I se fixe sur
l’épitope de la protéine d’intérêt. L’AC II biotinylé se dirige contre l’AC I. La streptavidine couplé à la peroxydase permet d’amplifier le signal car elle peut lier quatre molécules de biotine. La peroxydase va dégrader l’H2O2 et libérer de l’O2 qui va oxyder le substrat chromogène 3 Amino 9 ethyl carbazole (AEC).
Durant les travaux de cette thèse, le marquage indirect fut utilisé sur cellule et tissu puis le marquage indirect amplifié sur des coupes de tissu inclus en paraffine.
Les différents marquages sont visualisés au microscope Nikon®eclipse 80i et au microscope confocal (Olympus FV1000).
b) Immunofluorescence sur cardiomyocytes ventriculaires
Les cardiomyocytes ventriculaires isolés sont fixés avec du PFA 4% à température ambiante durant 30 minutes. Après rinçage des cellules au PBS 1X (3 fois 10 minutes), les cardiomyocytes sont perméabilisés avec du Triton 0,1% à température ambiante pendant 20 minutes. Les cellules sont à nouveau rincées au PBS 1X (3 fois 10 minutes) puis les sites de fixation non spécifiques sont bloqués grâce à une étape de saturation avec une solution de Glycine (111 mM) diluée dans du PBS et du sérum d’âne à 1% (Jackson ImmunoResearch). Ensuite les cardiomyocytes sont incubés avec les AC I dilués dans du PBS 1X toute la nuit en chambre humide à 4°C (Tableau 5).
Anticorps primaire Lot et fournisseur Dilution Anticorps secondaire Lot et fournisseur Dilution Connexine 43
(souris)
lot 2309061
Millipore 1/200ème
Ane anti souris couplé au FITC
Lot 115855
Jackson Immuno Research 1/50ème
KV4.3 (lapin)
lot 2355319
Millipore 1/200ème
Ane anti lapin couplé Alexa 555 Lot 1134920 Invitrogen 1/50ème N Cadhérine (lapin) lot GR1875961 Abcam 1/200ème
Chèvre anti lapin couplé au TRITC
Lot 114061
Jackson Immuno Research 1/1000ème
Tableau 5. Liste d'anticorps primaires et secondaires utilisés pour l'immunofluorescence sur cardiomyocytes ventriculaires et sur coupes tissulaires de ventricule.
Le lendemain, après 4 lavages avec du PBS 1X, les cellules sont incubées une heure avec les AC II couplés à des fluorochromes dilués dans du PBS 1X et du sérum d’âne à température ambiante. Les cellules sont ensuite rincées au PBS 1X puis les noyaux sont marqués au DAPI (Invitrogen) avec une dilution au 1/50000ème pendant 5 minutes à température ambiante. Après plusieurs rinçages au PBS 1X, les cellules sont montées entre lame et lamelle après ajout de milieu de montage (Fluoroshield, Sigma). Les cellules sont observées au microscope confocal (Olympus FV1000) grâce à un objectif à immersion à huile X60 avec une acquisition de 40 µs/pixel. Le paramétrage des longueurs d’onde d’excitation et d’émission utilisées est déterminé en fonction du spectre de chaque fluorophore (Tableau 6).
Fluorophore Longueur d'onde d'excitation (nm) Longueur d'onde d'emission (nm)
DAPI 405 425-475
AlexaFluor 555 559 570-650
Tableau 6. Liste des fluorophores utilisés. Fluorophores couplés aux AC II avec les longueurs d’onde
Pour les contrôles négatifs, les cardiomyocytes ont été incubés avec l’AC II sans incubation préalable avec l’AC I. Des contrôles positifs sont effectués sur des cellules HL-1 (lignée cellulaire atriale de souris) exprimant les connexines 40 et 43 (Dias et al., 2014).
c) Immunofluorescence sur coupe tissulaire de ventricules
Des prélèvements d’une dimension de 1,5 x 1,5 cm de VG, VD et RVOT sont effectués. La fixation de type physique consiste à congeler les échantillons dans de l’isopentane refroidi par l’azote (-80°C) pendant quelques secondes afin d’éviter des cryofractures. Par la suite, le tissu est inclus dans une colle liquide cryo-conservatrice, l’OCT
(optimal cutting temperature compound), et est placé à -10°C afin de réaliser des coupes
d’une épaisseur de 10 µm au cryostat Leica®
CM 1850UV. Les tranches de tissu sont déposées sur des lames en évitant tous replis. Ensuite, les lames sont conservées à -80°C. Lors du protocole d’immunofluorescence, les coupes sont fixées au PFA 4% pendant 2 minutes puis rincées 2 fois 3 minutes dans du PBS 1X. La saturation des sites aspécifiques est réalisée avec du sérum d’âne (Jackson ImmunoResearch) durant une heure. Après 2 rinçages de 3 minutes, les coupes sont incubées avec les AC I (connexine 43 et N-cadherine) dilués dans du PBS-Triton 0,1% toute la nuit à 4°C en chambre humide (Tableau 5). Le lendemain, après 2 lavages de 3 minutes au PBS 1X, les coupes sont incubées avec les AC II pendant une heure à température ambiante. Les lames sont à nouveau rincées 2 fois au PBS 1X. Les coupes rincées sont montées avec une contre lamelle et du mileu de montage (Prolong). Les lames sont observées au microscope Nikon® eclipse 80i à l’objectif X40 et analysées avec le logiciel NIS Elements3.2.
Le paramétrage des longueurs d’onde d’excitation et d’émission utilisées est déterminé en fonction du spectre de chaque fluorophore (Tableau 7).
Fluorophore Longueur d'onde d'excitation (nm) Longueur d'onde d'emission (nm)
Fluorescein FITC 465-495 515-555
Rhodamine (TRITC) 540-580 600-660
Tableau 7. Liste des fluorophores utilisés. Fluorophores couplés aux AC II avec les longueurs d’onde
d’excitation et d’émission associées.
d) Immunoenzymologie sur coupe tissulaire de ventricules
Les coupes de tissu réalisées au microtome (cf. Section Préparation des tissus : marquage au trichrome de Masson) sont déparaffinées par un bain de toluène durant 7
minutes puis progressivement hydratées par différents bain d’ETOH (100%, 95%, 80%) de 5 minutes chacun. Les coupes sont ensuite rincées à l’eau du robinet pendant 4 minutes et au PBS 1X durant 10 minutes avant le protocole de coloration.
Le protocole de coloration (kit Equipements Histostain-® SP Invitrogen® Système de Détection LAB-SA) est basé sur une reconnaissance de la protéine d’intérêt par une réaction immunoenzymologique impliquant la reconnaissance de la protéine d’intérêt par un AC I et une révélation via l’activité enzymatique de la peroxydase de raifort (radis noir).
L’élimination préalable de l’activité de la peroxydase endogène est nécessaire. De ce fait, les coupes de tissu sont plongées dans une solution refroidissante de peroxyde d’hydrogène à 3% diluée dans du méthanol à -20°C pendant 10 minutes.
Ensuite, les différentes sections de tissu sont prétraitées avec une solution de citrate de sodium pH 6 (Dako®) diluée au 1/10ème pendant 20 minutes à 100°C afin de démasquer les sites antigèniques. Après 3 rinçages au PBS 1X, les coupes de tissu sont incubées avec de l’avidine puis de la biotine (Dako®) à température ambiante afin de bloquer l’avidine et la biotine endogènes. Les coupes sont rincées abondamment au PBS 1X puis incubées avec une solution bloquante de sérum de chèvre à 10% durant 10 minutes afin de bloquer les sites non spécifiques. Les lames sont égouttées et incubées avec l’AC I connexine 43 (Millipore lot # 2194068) dilué au 1/250ème dans un tampon Dako® S3033 en chambre humide à 4°C durant la nuit. Le lendemain après 3 lavages au PBS 1X, les coupes de tissu sont placées avec l’AC II biotinylé durant 10 minutes. Les lames sont à nouveau rincées 3 fois au PBS 1X puis incubées avec l’enzyme conjuguée, la streptavidine-peroxydase, pendant 10 minutes à température ambiante. Les sections sont ensuite lavées 3 fois dans du PBS 1X.
Durant les étapes suivantes les lames doivent être protégées de la lumière directe.
Le peroxyde d’hydrogène à 0,6% et le substrat de l’enzyme soit le chromogène AEC (3 Amino 9 ethyl-carbazole) de couleur rouge, instable à la lumière sont placés sur les coupes de tissu pendant 5-10 minutes et colorent les protéines d’intérêt en marron.
La réaction enzymatique s’effectue selon l’équation suivante : H2O2 + RH2 → 2H20 + R
Il s’agit d’une réaction d’oxydoréduction avec une oxydation d’un substrat réduit (RH2) en un
produit oxydé coloré (R) grâce au peroxyde d’hydrogène (H2O2).
Les lames sont ensuite rincées à l’eau distillée et contre-colorées dans un bain d’hématoxyline durant une minute. Après un nouveau lavage à l’eau distillée afin d’éliminer l’excès d’hématoxyline, le montage des coupes s’effectue avec une lamelle et du ClearMountTM
. Les lames sont placées à sécher dans un incubateur à 60°C pendant 30 minutes. Les coupes de
tissu sont observées avec un microscope Nikon®eclipse 80i à l’objectif X40 et analysées avec le logiciel NIS Elements3.2.