Yana, I., and S J Weiss 2000 Regulation of membrane type-1 matrix metalloproteinase activation by proprotein convertases Mol Biol Cell 11:

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59. Zucker, S., M. Hymowitz, C. E. Conner, E. A. DiYanni, and J. Cao. 2002. Rapid trafficking of membrane type 1-matrix metalloproteinase to the cell surface regulates progelatinase a activation. Lab. Investig. 82:1673–1684.

II.3. Conclusions

Les travaux réalisés décrivent certains des liens existant entre la signalisation du TNF et la voie sphingomyéline/céramide par l’activation d’une cascade protéolytique complexe aboutissant à la prolifération des CML.

En effet, par un mécanisme qui reste inconnu à ce jour, le TNF active la pro-protéine convertase furine qui permet l’obtention d’une MT1-MMP mature et active (voir fig 8 de l’article précédent). S’ensuit une cascade de signalisation passant par l’activation d’une autre métalloprotéase, la MMP-2, qui, à son tour, active une sphingomyélinase neutre, la nSMase2, ce qui conduit à la génération de céramide. Enfin l’activation de la sphingosine kinase 1 et, de ce fait, la production de sphingosine-1-phosphate initie une cascade de signalisation de prolifération par phosphorylation de ERK1/2.

La voie SM/Céramide semble jouer un rôle clé dans la signalisation du TNF et les réponses biologiques telles que la vasoconstriction de l’endothélium, l’expression de la NO synthase endothéliale, la prolifération cellulaire et l’apoptose (Gaur et al., 2003 ; Goni et Alonso, 2002 ; Kolesnick et al., 1994 ; Kronke et al., 1999). Mais les liens entre TNF et nSMase ne sont pas connus. L’activation de la nSMase est pourtant un pré-requis pour la prolifération des CML et des fibroblastes induite par le TNF . Ceci a clairement été démontré par l’utilisation de SiRNA spécifiques de la sphingomyélinase neutre 2 humaine. L’utilisation du DMS, un inhibiteur de SK-1, inhibe également les effets prolifératifs du TNF sur les CML, montrant que la génération de S1-P est nécessaire à la voie de signalisation mitogène induite par le TNF . Les récepteurs au TNF peuvent aussi induire l’activation de sphingomyélinases acides par une partie de leur région membranaire (Adam et al., 1996 ; Goni et Alonso, 2002 ; Hannun et al., 1996 ; Kronke et al., 1999) conduisant à la production de céramide qui est proapoptotique (Pena et al., 1997). Il semble cependant que l’activation spécifique des sphingomyélinases neutres ou acides dépende de l’intensité du stimulus, du type cellulaire, des voies de signalisation concomitantes, des expressions géniques, de la SK-1 et de la balance entre facteurs proapoptotiques et antiapoptotiques (Auge et al., 1999 ; Hiraoka et al., 2001 ; Maupas-Schwalm et al., 2004 ; Spiegel et al., 2003 ; Wiegman et al., 1994 ; Xia et al., 1999). Notons que, dans nos conditions, (en absence d’un inhibiteur de synthèse protéique), l’activation de la nSMase par le TNF n’est pas associée à une apoptose cellulaire, ce qui est en accord avec des observations récentes de souris KO pour la nSMase2

qui ne montrent pas de défaut significatif d’apoptose (Aubin et al., 2005 ; Stoffel et al., 2005). Ceci est également en accord avec le rôle de la voie des sphingolipides dans les effets mitogènes induits par les LDLox et les activateurs de plasminogènes (Auge et al., 1999 ; Maupas-Schwalm et al., 2004 ; annexe 2).

Les intermédiaires moléculaires entre le TNF et l’activation de la nSMase2 ont été identifiés grâce à un inhibiteur de métalloprotéases, le batimastat, sur des cellules surexprimant un dominant négatif de MT1-MMP et à des cellules déficientes en MMP2. MT1-MMP et MMP2 sont nécessaires à l’activation de la nSMase2 par le TNF . Cependant, les relations précises entre MT1-MMP/MMP-2 et nSMase2 ne sont pas connues. La littérature décrit l’existence de complexes moléculaires formés par MT1-MMP, MMP-2 et des intégrines (Deryugina et al., 2001), ainsi que des complexes formés entre MT1-MMP, MMP- 2 et le TIMP2 (Sato et al., 1996). Nous n’avons pas testé cette hypothèse dans notre travail. Nous pouvons également imaginer que la nSMase2 interagit avec des composants de la matrice extracellulaire ou que des inhibiteurs spécifiques de la nSMase2 sont dégradés par MMP2. Une dernière hypothèse serait qu’il existe un rapprochement physique du complexe de métalloprotéases avec la nSMase, au niveau de zones particulières de la membrane résistantes aux détergents que sont les rafts ou radeaux lipidiques. Cette hypothèse est reprise dans la deuxième partie des résultats.

Notre travail a aussi permis d’identifier la furine comme intermédiaire entre le TNF et l’activation de MT1-MMP. Ceci a été démontré par l’utilisation de SiRNA spécifiques de la furine ou encore par des cellules transfectées par un inhibiteur de la furine, l’ 1-PDX. Les mécanismes d’activation de la furine par le TNF ne sont pas connus à ce jour. Une hypothèse est que le TNF active la maturation de la furine (Feliciangeli et al., 2006 ; Thomas G, 2002) mais à ce jour, aucun travail ne décrit le TNF comme un activateur du transport de la furine du réseau transgolgien à la membrane des cellules. Le stress oxydant pourrait intervenir dans ce processus. En effet, nous avons montré, par des expériences complémentaires non présentées ici, que la N-acétylcystéine inhibait totalement la cascade de signalisation induite par le TNF , passant par la furine, les MMPs, la voie des sphingolipides, et aboutissant à la prolifération des CMLs. Cette hypothèse est corroborée par des travaux qui montrent que le glutathion inhibe la nSMase ; l’activation de la nSMase est donc corrélée à une déplétion en glutathion (Singh et al., 1998 ; Liu et al., 1998).

En résumé, ce travail a permis d’apporter de nouvelles données sur les liens existant entre le TNF et l’activation de sphingomyélinases neutres impliquant la furine, les métalloprotéases MT1-MMP et MMP2. Cette voie de signalisation, qui n’est pas activée par les facteurs de croissance classiques comme le facteur de croissance dérivé des plaquettes ou le sérum de veau fœtal, pourrait, de ce fait, constituer un mécanisme général également utilisé par les agents induisant du stress oxydant comme les LDL oxydées, le stress oxydatif ou les cytokines, au cours du développement de pathologies comme le cancer ou l’athérosclérose.

II.4. Importance de la localisation membranaire des métalloprotéases dans