L’ensemble de ce travail a permis d’apporter des éléments à la compréhension de la régulation de la biodisponibilité du TNF !et des voies de signalisation qu’il induit dans les cellules musculaires lisses.
ADAM-17 est responsable du clivage du TNF !membranaire en TNF soluble, qui est impliqué dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Jusqu’à ce jour, il y avait très peu de données sur la régulation des clivages d’ADAM-17. Le travail présenté ci- dessus montre pour la première fois que la localisation de la forme active d’ADAM-17 dans les radeaux lipidiques pourrait constituer un moyen de régulation de son activité enzymatique. Ces données soulèvent plusieurs questions :
-) Pourquoi la littérature n’est pas unanime quant à la localisation d’ADAM-17 dans les radeaux lipidiques ?
En effet, bien qu’un travail récent montre une localisation d’ADAM-17 comparable à celle que nous décrivons (Thiel et Carpenter, 2006), des travaux antérieurs avaient localisé ADAM- 17 en dehors des radeaux lipidiques (Zimina et al., 2005 ; Von Tresckow et al., 2004). Toutefois, dans ces travaux, aucune distinction n’avait été faite entre la forme mature et immature d’ADAM-17, ce qui pourrait expliquer les conclusions des auteurs. D’autre part, nous avons constaté que les radeaux lipidiques contenant ADAM-17 étaient associés au cytosquelette, ce qui augmente leur densité et peut fausser l’interprétation des résultats obtenus après séparation des radeaux lipidiques sur gradient de sucrose.
-) Est-ce que le clivage de tous les substrats d’ADAM-17 se réalise dans les radeaux lipidiques ?
Dans leurs grande majorité, les substrats d’ADAM-17 ont été détectés dans les radeaux lipidiques (tableau 3) ce qui suggère que leur clivage peut se réaliser à ce niveau. Toutefois, une simple perturbation de l’homéostasie du cholestérol membranaire est capable de modifier la composition des radeaux lipidiques et conduire au clivage des substrats d’ADAM-17 à l’extérieur des radeaux lipidiques.
-) Quels sont les événements conditionnant l’entrée de la forme mature d’ADAM-17 et de ses substrats dans les radeaux lipidiques ?
L’incorporation d’une protéine transmembranaire dans les radeaux lipidiques est gérée par des processus encore mal définis. La composition de la séquence de la protéine, en particulier au
niveau de la région transmembranaire et des régions juxta-membranaires, pourrait être impliquée dans leur intégration dans les radeaux lipidiques. Des modifications post- traductionnelles de type phosphorylation, palmitoylation, myristoylation touchant la partie cytoplasmique de certaines protéines transmembranaires ont été impliquées dans leur intégration dans les radeaux lipidiques (cf introduction bibliographique). Enfin la fixation d’un ligand à un récepteur a été associée à la translocation du complexe dans les radeaux lipidiques. Ceci peut cependant être le résultat d’une modification post-traductionnelle ou tridimensionnelle du récepteur induite par le ligand.
Aucune étude à ce jour ne s’est intéressée aux événements conditionnant la présence de la forme mature d’ADAM17 dans les radeaux lipidiques. Ces derniers s’organisent dans le RE et la présence de la forme pro d’ADAM-17 dans ces domaines devrait témoigner d’une intégration spontanée au cours de sa synthèse. Or, en conditions normales, la forme pro d’ADAM-17 ne se retrouve pas dans les radeaux lipidiques, ce qui suggère que l’intégration se réalise après le golgi médian où se réalise la maturation par la furine. L’intégration d’ADAM-17 dans les radeaux lipidiques nécessiterait une ou des modifications post- traductionnelles différentes de sa maturation par la furine et qui restent à être définies.
Il est très probable que des processus variés régulent l’entrée des différents substrats d’ADAM-17 dans les radeaux lipidiques. Nous nous sommes intéressés au TNF !et un travail préliminaire suggère l’importance de la palmitoylation dans son intégration dans les radeaux lipidiques. En effet, un TNF rendu non palmitoylé par mutagénèse s’intègre moins dans les radeaux lipidiques que le TNF sauvage.
La deuxième partie de ce travail de thèse concerne les voies de signalisation activées par le TNF . Nous montrons pour la première fois un mécanisme d’activation de SMases neutres par le TNF initié par une cascade protéolytique impliquant une protéine convertase (la furine) et des métalloprotéases (MT1-MMP et MMP-2) et aboutissant à l’activation des MAPK. Ces résultats ont également posé un certain nombre de questions :
-) D’autres sphingomyélinases sont-elles activées par le TNF dans cette voie de signalisation ?
Notre travail a identifié la sphingomyélinase neutre de type 2 dans l’effet mitogène médié par le TNF . Des expériences préliminaires, conduites dans des conditions permettant de doser la
sphingomyélinase acide ont permis d’exclure cette enzyme de la signalisation mitogène induite par le TNF .
-) Le TNF induit-il la prolifération cellulaire par cette voie dans tous les types cellulaires ?
Les travaux du laboratoire montrent que, dans les cellules musculaires lisses, cette voie est activée par de nombreux agents « de stress » comme les LDLox, H2O2 ou encore les
activateurs du plasminogènes (Augé et al., 2004 ; Maupas-Schwalm et al., 2004). Toutefois, nous avons observé que le TNF n’active pas cette voie dans les cellules MCF7. Ces observations sont à rapprocher des travaux de Marchesini (Marchesini et al., 2004) qui ont montré que contrairement à ce que nous avons observé sur les CML, la transfection des MCF- 7 par la sphingomyélinase neutre de type 2 inhibe la prolifération cellulaire. Il convient donc de poursuivre ces études sur d’autres types cellulaires afin de répondre à cette question.
-) Quels sont les liens entre le TNF " la furine et les métalloprotéases ?
Le transport de la furine est essentiel à la voie de signalisation que nous avons mise en évidence. Le TNF agit donc peut-être sur des molécules qui activent le transport vésiculaire à partir de l’appareil de golgi. Mais il se peut aussi que le TNF induise l’activation de la furine par des protéines intermédiaires. Les perspectives de ce travail concernent la recherche de ces nouveaux acteurs protéiques impliqués dans la cascade de signalisation.
Ainsi, la mise en évidence de cette voie de signalisation apporte des connaissances nouvelles sur le rôle potentiel du TNF dans la genèse des plaques d’athérome à travers une action sur l’activation précoce de protéases (furine et métalloprotéases). Ces enzymes ont un rôle particulièrement important dans le processus d’athérosclérose et il est actuellement décrit qu’elles pourraient intervenir suite à la stimulation de leur production via de nombreux agents pro-athérogènes. Sans pour cela rejeter ces hypothèses, notre travail démontre que au-delà de la stimulation de leur production des agents comme le TNF ont le pouvoir de stimuler la maturation des pro-enzymes afin d’induire la prolifération des cellules musculaires lisses.
L’ensemble de ces travaux de thèse montrent donc la complexité des relations protéines-protéines puisqu’ils se focalisent sur les interactions entre des protéases (substrat de la furine) et le TNF . Nous montrons ici que la furine agit physiologiquement en amont du TNF !puisque via ADAM-17 elle module l’apparition du TNF actif au sein des radeaux
lipidiques. Ce TNF semble ensuite activer la furine qui agit alors sur la voie métalloprotéases/sphingolipides et médie la prolifération cellulaire. Les résultats préliminaires que nous présentons en fin de thèse montrent que pour conduire à la prolifération cellulaire la cascade de signalisation doit toucher des cibles situées hors radeau lipidique. Des recherches complémentaires doivent être réalisées afin de comprendre les mécanismes exacts de ces interactions afin de moduler la prolifération des cellules musculaires lisses qui représente une étape majeure de l’athérogénèse.