Le volet amphiphile ou « lid »

1.5.4. Le volet amphiphile ou « lid »

La détermination des premières structures de lipases par cristallographie, a révélé la présence d’un volet amphiphile fréquemment rencontré chez les lipases et constitué d’une ou plusieurs hélices  présentant une longueur et une complexité variables selon l’enzyme considérée. La résolution de structure de lipases cristallisées en présence d’inhibiteurs mimant le substrat dans le site actif a permis de mettre en évidence plusieurs conformations intermédiaires de ce volet, aussi appelé « lid » (Figure 8) (Brzozowski et al. 1991, Derewenda et al. 1992b, Grochulski et al. 1993, Grochulski et al. 1994a). En conformation qualifiée de « ouverte », la surface hydrophobe exposée est augmentée et le site catalytique devient accessible au substrat (Brady et al. 1990, Winkler et al. 1990, Derewenda et al. 1992a).

Figure 8. Structure de la lipase de Rhizomucor miehei avec le lid en conformation fermée en bleu (PDB ID : 3GTL) (Brzozowski et al. 1992) et en conformation ouverte en violet (PDB ID : 4GTL) (Derewenda et al. 1992a). L’inhibiteur suicide, le diéthylphosphonate, est représenté en sphères colorées en vert, il est présent uniquement dans la conformation ouverte. Les acides aminés catalytiques représentés en sticks sont indiqués, D pour l’aspartate 203, H pour l’histidine 257 et S pour la sérine 144.

Le passage d’une conformation fermée à une conformation ouverte a fourni une possible explication mécanistique au phénomène d’activation interfaciale mentionné précédemment. Ainsi, en l’absence d’interface hydrophobe, la conformation fermée est prédominante expliquant la faible activité catalytique observée. Lorsque la concentration en substrat est augmentée, et passe au-dessus de la concentration micellaire critique, la

18 formation d’une interface hydrophobe par le substrat insoluble permet une transition de la lipase vers une conformation ouverte ayant une activité catalytique accrue.

Néanmoins ce mécanisme reste mal compris. Ainsi la découverte de lipases présentant un volet amphiphile mais ne présentant pas ce phénomène d’activation interfaciale telle que la lipase de Pseudomonas aeruginosa (Jaeger et al. 1993) ou encore d’enzymes lipolytiques autres que les lipases ne possédant pas de volet amphiphile mais présentant un phénomène d’activation interfaciale telle que la phospholipase A2 pancréatique, (Pieterson et al. 1974), suggère un lien complexe entre l’activité et les états conformationnels du lid.

Par ailleurs, certaines lipases ont pu être cristallisées en l’absence d’inhibiteur suicide sous forme ouverte, telle que la lipase de Burkholderia cepacia (PDB ID : 2LIP, 3LIP) (Schrag et al. 1997b), ou partiellement ouverte telle que la lipase de Rhizopus delemar (PDB ID : 1TIC) (Derewenda et al. 1994) et celle de Thermomyces lanuginosa (PDB ID : 1DT3, 1DT5, 1DTE) (Brzozowski et al. 2000). La stabilisation de structures ouvertes ou partiellement ouverte du lid en l’absence de ligand suggère donc une dynamique plus complexe et il est probable que la nature des acides aminés constituant le lid ainsi que sa longueur jouent un rôle clef dans sa mobilité conformationnelle et influent donc grandement sur l’activité et la spécificité vis-à-vis du substrat (Brocca et al. 2003, Skjot et al. 2009).

Plusieurs techniques ont été utilisées pour explorer la dynamique et les changements conformationnels des lipases. On peut ainsi citer la fluorescence (Luthi-Peng et al. 1992, Yapoudjian et al. 2002), la diffraction des neutrons (Hermoso et al. 1997), la diffusion des neutrons aux petits angles (Pignol et al. 2000), la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (Noinville et al. 2002) ou la résonance paramagnétique électronique (RPE) (Belle et al. 2007). Cette dernière technique a permis d’obtenir des informations particulièrement intéressantes sur la dynamique du lid de la lipase pancréatique humaine (HPL). L’introduction d’une cystéine par mutation d’un acide aminé du lid (D249C) a permis de fixer une sonde paramagnétique sur le lid de la HPL. De façon intéressante, le passage d’une conformation fermée à une conformation ouverte s’est accompagné d’une restriction de la mobilité de la sonde. Cela a permis de discriminer entre les états ouvert et fermé et d’étudier l’influence de la présence de sels biliaire, le sodium taurodeoxycholate (NaTDC), et de la colipase sur l’équilibre conformationnel du lid de la HPL entre les états fermé et ouvert. La présence de NaTDC au-delà de 1 mM déplace l’équilibre en faveur de la conformation ouverte, cet effet étant accentué par la présence de la colipase. Toutefois, la colipase seule ne modifie pas l’équilibre conformationnel. La colipase aurait donc un effet stabilisateur sur l’ouverture du lid par le NaTDC. De plus, une dilution de la concentration en NaTDC a entrainé un retour de l’équilibre en faveur de la conformation fermée malgré la présence de la colipase, retour qui a été inhibé par l’ajout d’un inhibiteur suicide se liant à la sérine

19 catalytique et immobilisant les résidus du trou oxyanion. Ainsi, cette étude a démontré le rôle déterminant joué par les sels biliaires dans l’ouverture du lid de la HPL.

La RPE a également permis de mesurer les distances entre la cystéine 249, située dans le lid du variant D249C, et la cystéine C181, située dans une boucle en face du lid, pour les conformations fermée et ouverte en solution par « Double Electron – Electron Resonance » (DEER) (Ranaldi et al. 2010). Ainsi à l’aide de deux sondes paramagnétiques, des distances de 19 Å et 42 Å ont été estimées pour les conformations fermée et ouverte, respectivement. Ces distances mesurées en solution sont identiques à celles retrouvées dans les structures cristallographiques de HPL en conformations fermée (PDB ID : 1N8S) et ouverte (PDB ID : 1lPB), supportant l’hypothèse que ces conformations déterminées par cristallographie existent en solution.

En l’absence de techniques biophysiques permettant d’appréhender les échelles de temps auxquelles se produisent les changements conformationnels des domaines protéiques, la dynamique moléculaire est une bonne alternative puisqu’elle permet de simuler les réarrangements conformationnels se produisant au cours du temps et d’accéder à une description atomistique. Un exemple en est donné pour la lipase de Burkholderia cepacia (BCL). Seule la structure cristallographique ouverte de cette lipase est disponible, que ce soit avec ou sans inhibiteur / substrat (Kim et al. 1997, Schrag et al. 1997b, Lang et al. 1998, Luic et al. 2001, Mezzetti et al. 2005, Luic et al. 2008). Le lid de BCL est constitué des résidus 118 – 159 et est formé par les hélices 4 et 5 reliées par une boucle. A partir de la forme ouverte, une simulation de dynamique moléculaire de 20 ns en solvant aqueux a permis de passer à une forme fermée alors que la même simulation en solvant apolaire, l’octane, ou en présence d’une interface hydrophobe, eau / octane, n’a pas permis d’atteindre cette conformation fermée (Barbe et al. 2009). Une seconde simulation à partir de la conformation fermée placée en solvant apolaire, l’octane, a permis de repasser à une conformation ouverte du lid de BCL. En plus de souligner le rôle crucial de l’environnement sur la dynamique du lid de BCL, cette simulation a également mis à jour les détails du mécanisme de fermeture et d’ouverture du lid. Ainsi des simulations de dynamique moléculaire restreinte ont montré l’importance des résidus 214 – 261. Ces résidus forment notamment l’hélice 9 qui fait face au lid. Alors que des restreintes des mouvements du squelette peptidique et des chaines latérales de ces résidus bloquent le lid dans une conformation semi-fermée, la mobilité des chaines latérales seules suffit pour passer à une conformation pleinement fermée. Le même phénomène est observé lors de l’ouverture du lid lors de simulations de dynamique moléculaire restreinte à partir de la forme fermée en solvant apolaire. L’importance de la nature des résidus constituant le lid a aussi été mise en évidence en remplaçant un acide aminé apolaire, la valine V138, par un résidu apolaire de faible taille, une alanine, ou un résidu polaire, une sérine. Ces changements ont conduit

20 à une impossibilité du lid à repasser en conformation fermée en solvant aqueux. Un phénomène analogue a été observé pour la mutation de la phénylalanine F142 en sérine. Cette mutation F142S empêche la fermeture du lid en le stabilisant dans une conformation intermédiaire. Cette étude de BCL par dynamique moléculaire illustre la complexité de la dynamique du lid en montrant l’implication du solvant, des interactions inter-domaines et de la composition du lid dans cette dynamique. Une étude semblable par dynamique moléculaire du lid de BCL a permis de retrouver le rôle crucial joué par l’environnement sur la conformation du lid de BCL (Trodler et al. 2009).