La protéine « Outer membrane protein A »

Comme mentionné précédemment, la protéine OmpA est constituée de deux domaines, un domaine N-terminal transmembranaire et un domaine C-terminal périplasmique.

La structure du domaine N-terminal d’Escherichia coli (N-EcOmpA) a été résolue par cristallographie (PDB ID : 1BXW et 1QJP) (Pautsch et al. 1998, Pautsch et al. 2000) et par RMN en solution (Figure 22) (PDB ID : 1G90 et 2GE4) (Arora et al. 2001, Cierpicki et al. 2006). Les 8 brins  antiparallèles du tonneau  forment un angle de 45° avec la normale de la bicouche lipidique et sont connectés par 3 courts turns du côté périplasmique et par 4 longues boucles du côté extracellulaire (Pautsch et al. 1998). La surface du tonneau est constituée de résidus apolaires et de résidus aromatiques, ces derniers étant retrouvés à la hauteur de l’interface de la bicouche lipidique. L’intérieur du tonneau est polaire et les chaines latérales forment un réseau hydrogène dense. Malgré la présence de poches remplies par des molécules d’eau, aucun canal permettant une diffusion de molécules n’est visible. Un pont salin entre un glutamate (E52) et une arginine (R138) flanqué par une phénylalanine (F40) et une tyrosine (Y94) constitue la barrière principale à une éventuelle diffusion de molécules dans le tonneau. Le faible facteur B cristallographique témoigne de la rigidité des chaines latérales participant au réseau d’interaction à l’intérieur du tonneau. Alors que le tonneau présente une forte structuration, les boucles présentent une mobilité élevée. Ainsi, les boucles L1, L2 et L4 n’ont pas de densité électronique dans la structure cristallographique (Pautsch et al. 1998).

La structure RMN de OmpA a permis de retrouver les principaux éléments mis à jour par la cristallographie (Figure 22) (Arora et al. 2001). Ainsi, OmpA solubilisée en dodécylphosphocholine (DPC) adopte le même repliement que celui trouvé dans la structure cristallographique en présence du n-octyltétraoxyéthylène. Les boucles extracellulaires présentent une grande variabilité due à l’absence de contraintes

47 structurales à ce niveau (Arora et al. 2001). Toutefois, les brins  de la structure RMN sont de 1 à 3 résidus plus courts que dans la structure cristallographique. De plus la RMN permet de mettre en évidence « un gradient de mobilité » se répartissant du centre du tonneau  jusqu’au niveau des boucles avec des mouvements µs – ms au niveau des extrémités du tonneau  qui se traduisent par une diminution de l’intensité et un élargissement du signal à ce niveau (Arora et al. 2001).

Figure 22. Structure par RMN de OmpA. A. OmpA de Klebsiella pneumoniae en micelle de DHPC (PDB ID : 2K0L) B. OmpA d’Escherichia coli en micelle de DPC (PDB ID : 2GE4). Les résidus aromatiques situés à hauteur de l’interface de la bicouche lipidique sont colorés en orange. Les quatre boucles extracellulaires ainsi que les extrémités périplasmiques N- et C-terminales sont indiquées.

La structure RMN du domaine N-terminal de Klebsiella pneumoniae (N-KpOmpA) a été résolue dans l’équipe de RMN de l’IPBS en 2009 (Figure 22) (PDB ID : 2K0L) (Renault et al. 2010). Cette structure a été résolue par RMN en présence de DHPC et avec la séquence native de la protéine alors que l’introduction de mutations avaient été nécessaires dans les études cristallographiques et RMN de EcOmpA. De plus, les boucles L1 et L3 sont plus longues chez Klebsiella pneumoniae que chez Escherichia coli. La structure et la dynamique en solution de KpOmpA sont très semblables à celles mise en évidence chez Escherichia coli (Arora et al. 2001, Renault et al. 2010). Notamment le gradient de mobilité a été retrouvé et caractérisé plus en détail chez KpOmpA. L’échelle de temps des mouvements de KpOmpA en DHPC va ainsi de la semaine (observation de l’échange de protons amides) au cœur du tonneau  à la nanoseconde au niveau des boucles en passant par la milliseconde au niveau de l’interface de la bicouche lipidique (observation d’élargissements de raies sur les spectres HSQC). Ce gradient de mobilité est aussi présent

48 quand KpOmpA est inséré dans une bicouche lipidique, un environnement plus proche de la membrane externe que les détergents (Iordanov et al. 2012). Après reconstitution en protéoliposome de KpOmpA, des mouvements intermédiaires de type µs – ms ont été mis en évidence au niveau de l’interface entre les boucles et le tonneau  par RMN du solide. De plus cette étude a montré que toutes les régions des boucles n’avaient pas la même mobilité (Renault et al. 2009, Iordanov et al. 2012). Les boucles L2, L4 et les parties N-terminales de L1 et L3 présentent également une mobilité restreinte avec des caractéristiques dynamiques typiques des mouvements intermédiaires. Seules les parties C-terminales de L1 et L3 présentent des caractéristiques dynamiques de boucle avec des mouvements rapides de type nanoseconde. Les boucles extracellulaires de KpOmpA jouent un rôle important dans les propriétés immunologiques de la protéine telle que la reconnaissance médiée par les récepteurs LOX-1 et SREC-1 ou encore la reconnaissance humorale médiée par PTX3 (Jeannin et al. 2005, Smith et al. 2007, Confer et al. 2013). Ayant un rôle dans la régulation de la réaction hôte-pathogène, la dynamique de ces boucles est susceptible de moduler cette réaction en intervenant lors de l’interaction avec différents ligands.

La présence d’un second domaine en C-terminal susceptible de se lier au peptidoglycane laisse penser que OmpA pourrait avoir un rôle structural dans la cohésion de l’enveloppe bactérienne, le domaine N-terminal ayant une fonction d’ancrage dans la membrane externe. La réponse du domaine transmembranaire à une tension mécanique a été étudiée dans l’équipe de RMN de l’IPBS en collaboration avec D.J. Muller, ETH Bâle, par microscopie à force atomique (AFM) et spectrométrie de forces sur molécule unique (SMFS) (Bosshart et al. 2012). Ainsi, sous l’effet d’une force de traction appliquée au domaine C-terminal, le domaine N-terminal de KpOmpA va se déplier par étapes successives. Les brins 8 – 7 – 6 forment la première étape, suivis par les brins 5 - 4 lors de la deuxième étape, les brins 3 – 2 dans une troisième étape et le brin 1 en dernière étape. De façon intéressante, la force nécessaire pour extraire le brin 1 est deux à quatre fois plus importante que pour les étapes précédentes. Enfin si le brin 1 n’est pas extrait et que la force appliquée est relâchée, N-KpOmpA est capable de se renaturer dans la membrane comme en témoigne le fait que les profils de dépliement obtenus après repliement sont identiques à ceux obtenus avant repliement. KpOmpA pourrait ainsi jouer un rôle d’absorbeur de stress mécanique et y répondre en se dépliant par étapes puis en se repliant une fois celui-ci passé.

Le domaine C-terminal de OmpA est commun à de nombreuses autres protéines périplasmiques des bactéries Gram-négatives. Ce domaine est désigné comme « OmpA domain » ou « OmpA-like domain » dans les bases de données PFAM et PROSITE

49 respectivement et suit un repliement de type //// (Figure 23) (Sigrist et al. 2013, Finn et al. 2014). Parmi les protéines comportant un domaine OmpA en C-terminal, on retrouve des porines telles que OmpA mais aussi des lipoprotéines associées au peptidoglycane (Pal) ou des protéines du moteur flagellaire telles que MotB. Chez les porines, les deux domaines sont reliés par une séquence riche en proline comprenant un motif formé par la répétition à quatre reprises du tandem AP chez Klebsiella pneumoniae OmpA, Escherichia coli OmpA et Salmonella enterica OmpA. Le domaine C-terminal soluble se situe au niveau périplasmique où il interagit avec le peptidoglycane (Figure 23) (Parsons et al. 2006, Park et al. 2012). Plusieurs structures sont disponibles dont celles de Neisseria meningitidis (PDB ID : 1R1M), Escherichia coli (PDB ID : 2MQE) ou Salmonella enterica (PDB ID : 4ERH) (Grizot et al. 2004, Ishida et al. 2014). Bien que présentant des identités de séquence de l’ordre de 20-30%, les domaines OmpA-like présentent une remarquable conservation de leur structure tertiaire.

Figure 23. Domaine OmpA-like. A. Structure cristallographique du domaine C-terminal de Omp38 d’Acinetobacter baumannii en complexe avec un pentapeptide synthétique retrouvé dans le peptidoglycane. Les deux acides aminés importants pour l’interaction avec le DAP, une arginine et un aspartate, ont été représentés en rouge. B. Structures de différents domaines OmpA-like. Le cœur du domaine est coloré en vert, bleu et gris pour les brins , les hélices  et les boucles respectivement. Les variations structurales et les structures supplémentaires en N-terminal sont colorées en rouge et en jaune pâle du côté C-terminal. L’élongation de la boucle 3 – 3 et le pont disulfure retrouvés dans certains domaines sont colorés en orange et en jaune respectivement. Les identifiants PDB de chaque structure sont indiqués.

50 Les principales variations se situent au niveau des extrémités N- et C-terminales du domaine où des brins  et des hélices  supplémentaires peuvent être présentes comme dans MotB de Helicobacter pylorii (PDB ID : 1CYQ) ou de Salmonella enterica (PDB ID : 2ZVY) (Kojima et al. 2008, Roujeinikova 2008). Le brin 1 présente également une grande variabilité de structure et peut-être remplacé par une hélice  comme chez Mycobacterium tuberculosis (PDB ID : 2KGW) ou dans les Pal telle que celle de Yersinia pestis (PDB ID : 4PWT) (Yang et al. 2011). La partie la plus variable du cœur du domaine OmpA-like se situe entre le brin 3 et l’hélice 3 où la longueur de la boucle varie en fonction du domaine considéré. En général longue de 8 – 10 résidus, cette boucle est allongée à 15 résidus chez Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli et Salmonella enterica, Neisseria meningitidis ayant la boucle la plus longue avec 26 résidus qui s’organisent pour former une hélice  supplémentaire (Figure 23) (Grizot et al. 2004). De façon intéressante, les domaines OmpA-like présentant une boucle 3 – 3 possèdent un pont disulfure absent dans les autres séquences homologues ce qui suggère que la structuration de cette partie du domaine est importante. Plusieurs travaux ont suggéré que ces domaines OmpA-like pouvaient former des dimères, in vitro pour Escherichia coli OmpA, ou in vivo pour Salmonella enterica MotB (Kojima et al. 2008, Kojima et al. 2009, Marcoux et al. 2014). En plus du rôle d’ancrage du peptidoglycane, il a été montré que ce domaine pouvait jouer un rôle de chaperonne lors du repliement de OmpA en réduisant les phénomènes d’agrégation dus au domaine N-terminal non replié (Danoff et al. 2011).

La structure et la dynamique du domaine C-terminal de OmpA de Klebsiella pneumoniae ont été caractérisés par cristallographie et par RMN dans le cadre de cette thèse.