Biogenèse des protéines de la membrane externe

2.4.1. Le passage de la membrane interne

Contrairement aux protéines transmembranaires à hélice  qui sont insérées dans la membrane au cours de la traduction, l’insertion dans la membrane externe est post-traductionnelle pour les OMP. Les OMP sont traduites dans le cytoplasme sous forme de précurseur avec une courte séquence signal en N-terminal. La chaperonne SecB maintient la chaine peptidique sous forme non repliée (Figure 21) (Bechtluft et al. 2010). La chaine peptidique est alors exportée à travers la membrane interne par l’ATPase SecA à travers le complexe transmembranaire SecYEG (de Keyzer et al. 2003, Kusters et al. 2011).

2.4.2. Les voies des chaperonnes

Dans l’espace périplasmique, la chaine peptidique est prise en charge par les chaperonnes Skp (Chen et al. 1996, Harms et al. 2001, Korndorfer et al. 2004, Burmann et al. 2013) et SurA, cette dernière possédant une activité peptidyl-prolyl isomérase et reconnaissant préférentiellement les séquences peptidiques riches en résidus aromatiques (Figure 21) (Lazar et al. 1996, Behrens et al. 2001, Bitto et al. 2002, Xu et al. 2007). Il a été montré que Skp assiste le repliement d’OmpA en présence de LPS (Schafer et al. 1999, Bulieris et al. 2003). De plus Skp est capable de lier le domaine N-terminal de OmpA non replié sans perturber le repliement correct du domaine C-terminale (Walton et al. 2009). SurA pourrait jouer un rôle prépondérant dans l’activité chaperonne au niveau du périplasme tandis que Skp aurait un rôle de voie de secours avec la protéine DegP. Ainsi les mutations SurA-/Skp- et SurA-/DegP- présentent un effet bactériostatique et bactéricide respectivement ce qui n’est pas le cas des mutations Skp-/DegP- (Rizzitello et al. 2001). Toutefois, l’importance de chacune des voies restent à déterminer ; ainsi il a été observé que les mutations Skp-/DegP- entrainaient un arrêt de la croissance dépendant de la température avec une accumulation de protéines mal repliées dans le périplasme (Schafer et al. 1999). Ainsi des interactions au sein d’un réseau plus complexe ou une action séquentielle de ces deux chaperonnes n’est pas exclue.

D’autres protéines sont susceptibles d’intervenir à ce stade telles que DsbA qui catalyse la formation de ponts disulfures ou la protéine DsbC qui réduit les cystéines ayant formé des ponts disulfures incorrects, les cystéines réduites par DsbC pouvant par la suite être oxydées par DsbA pour former les ponts disulfures corrects (Merdanovic et al. 2011). Ainsi, il a été démontré qu’une absence de DsbA s’accompagnait d’un défaut de formation

44 du pont disulfure présent dans OmpA et d’une cinétique de repliement plus longue (Bardwell et al. 1991).

Figure 21. Modèle de la synthèse et de l’export des OMP dans la membrane externe. Au niveau cytoplasmique, les chaperonnes SecB prennent maintiennent la chaine peptidique néo-synthétisé sous forme non replié pour permettre son export par le système Sec dans le périplasme. Les chaperonnes périplasmique SurA et Skp vont adresser la OMP à la machinerie BAM qui va assurer son insertion dans la membrane externe. Les protéines DsbA et DsbC catalysent la formation de ponts disulfures tandis que la protéine DegP prend en charge les OMP mal repliées présentes au niveau du périplasme.

Les OMP mal repliées présentes au niveau du périplasme sont prises en charge par la protéase DegP (Figure 21). Cette protéine possède une activité protéase et une activité chaperonne, le changement entre les deux fonctions étant contrôlé par la température (Spiess et al. 1999). Sous forme inactive, DegP forme un hexamère. La liaison d’un substrat mal replié entraine la formation de 12-mer ou de 24-mer qui vont s’organiser

45 sous la forme d’une cage encapsulant le substrat dans sa cavité centrale (Jiang et al. 2008). La cavité centrale a ainsi une taille suffisante pour accueillir une OMP repliée (Krojer et al. 2008). De nombreuses OMP peuvent être substrat de DegP telles que OmpA, OmpC, OmpF ou LamB (Krojer et al. 2008). Toutefois, une fois correctement repliée, il n’est pas clair si la OMP va réintégrer la voie périplasmique des chaperonnes ou si elle va être insérée dans la membrane externe (Ricci et al. 2012). Ainsi, le rôle respectif des chaperonnes SurA, Skp et DegP dans les voies de prise en charge et de repliement des OMP au niveau du périplasme reste encore à définir (Sklar et al. 2007).

2.4.3. La machinerie BAM

L’insertion des OMP dans la membrane externe est assurée par la « -Barrel Assembly Machinery » (BAM). Le complexe BAM est formé par BamA, une OMP composée d’un tonneau  transmembranaire et de 5 domaines « polypeptide translocation associated » (POTRA) périplasmiques placés en N-terminal avec lesquels vont venir interagir 4 lipoprotéines, BamB, BamC, BamD et BamE (Figure 21) (Wu et al. 2005, Kim et al. 2007, Ni et al. 2014). BamB et BamD interagissent directement avec BamA alors que BamC et BamE forment un sous-complexe avec BamD. Il a été montré que les lipoprotéines BamB et BamD étaient capables de lier BamA non repliée et de faciliter son repliement et son insertion dans la membrane in vitro. BamD lie également OmpA non repliée mais BamA est indispensable pour un repliement et une insertion correcte de OmpA (Hagan et al. 2013). Il a été également proposé que le dernier brin  du tonneau des OMP comportait un signal de reconnaissance et d’adressage à la membrane externe (de Cock et al. 1997). Ainsi, ce brin  se termine presque toujours par un résidu aromatique, une phénylalanine le plus souvent (de Cock et al. 1997). Alors que la mutation ou la délétion de ce résidu bloque l’assemblage in vivo et entraine une accumulation des OMP au niveau du périplasme, ces variants se replient correctement dans une bicouche lipidique in vitro (Jansen et al. 2000, Misra et al. 2000).

La résolution des structures de BamA de Neisseria gonorrhoea et de Haemophilus ducreyi a mis en évidence la structure particulière du tonneau  transmembranaire (Noinaj et al. 2013). Le tonneau est constitué de 16 brins  antiparallèles formant un canal de 13000 Å3. L’intérieur de ce canal présente une surface fortement électronégative. Du côté extracellulaire, le tonneau est fermé par les boucles extracellulaires L4, L6 et L7. Du côté périplasmique, alors que la structure chez Haemophilus ducreyi est pleinement ouverte sur le périplasme, le domaine POTRA 5 empêche tout accès dans la structure de Neisseria gonorrhoea. De plus, les brins 1 et 16 interagissent par 8 liaisons hydrogènes chez Haemophilus ducreyi alors qu’une seule liaison hydrogène est présente chez Neisseria gonorrhoea où le brin C-terminal se tord vers l’intérieur du tonneau . Ces deux structures

46 pourraient refléter deux conformations de BamA où le domaine POTRA 5 et les brins 1 et 16 joueraient le rôle de porte avec le périplasme et la bicouche lipidique respectivement. La conformation retrouvée dans la structure de Haemophilus ducreyi serait alors la conformation ouverte sur le périplasme alors que la conformation retrouvée dans la structure de Neisseria gonorrhoea se rapprocherait plus d’une conformation fermée sur le périplasme et prête à s’ouvrir sur la bicouche lipidique. Des mécanismes similaires d’ouverture latérale sur la bicouche lipidique ont été décrits chez FadL, un transporteur de d’acide gras, ou PagP, une palmitoyl transférase, tous deux présents dans la membrane externe d’Escherichia coli (Hearn et al. 2009, Cuesta-Seijo et al. 2010).