Dans la publication 1, l'expression de la plupart des transcrits codant des FT régulant la LCR a été mesurée. Cette évaluation n'a pas permis de mettre en évidence une modification de leur expression transcriptionnelle. Bien que cette observation ne soit pas une preuve formelle, elle suggère que ces FT ne sont pas impliqués dans la répression de E6 lors du traitement des cellules avec le 5azadC. Les études sur l'implication des FT dans cette répression ont été complétées par des expériences concernant TBX2, présentées dans la publication 2. L'intérêt pour ce FT a été suscité par une publication de Schneider et collaborateurs, montrant qu'il pouvait avoir une activité répresseur sur l'expression de E6. TBX2 est un FT répresseur, contrairement à la plupart des membres de sa famille, et il est régulé par méthylation dans certaines tumeurs.
L'expression transcriptionnelle de TBX2 est modifiée par le traitement des cellules SiHa et Ca Ski avec le 5azadC. Dans les cellules SiHa, une augmentation progressive au cours du temps et en fonction de la concentration utilisée est visualisée, avec une surexpression à 96 h entre 1,3 à 0,25 µM et 3,5 à 5 µM. Il est intéressant de noter que les faibles différences d'expression entre 24 h et 72 h à 0,25 µM ne sont pas significatives, contrairement à celles observées pour l'expression transcriptionnelle de E6. Dans les cellules Ca Ski, l'expression transcriptionnelle de TBX2 n'augmente pas à 0,25 µM quel que soit le temps, et diminue même à 48 h de manière significative. Il est intéressant de noter que pour cette lignée, le dosage des ARN de TBX2 en qPCR était moins aisé qu'avec les cellules SiHa. En effet, les mesures effectuées pour chaque condition étaient moins reproductibles, à cause des faibles quantités des transcrits, se traduisant par des Ct élevés. Pour des concentrations de 5 µM en 5azadC, l'expression de TBX2 diminue significativement dans un premier temps, avant d'augmenter fortement jusqu'à 3,8 fois à 96 h. Concernant l'expression de la protéine en revanche, nous n'avons pas visualisé de bandes en western blotting pour aucune des deux lignées, même après traitement avec le 5azadC à 5 µM. Ces résultats sont en contradiction avec ceux de Schneider et collaborateurs, qui ont observé une très faible expression de la protéine dans les cellules SiHa. Fait intéressant, TBX2 semble être exprimé uniquement dans la couche la plus superficielle de l'épithélium malpighien, et Schneider et collaborateurs émettent l'hypothèse que le niveau de TBX2 pourrait être accru après la différenciation des cellules. Puisque les conditions de cultures modulent l'état de différenciation des cellules, par exemple la concentration de calcium dans le milieu (Kalantari et al, 2008), ou encore l'utilisation d'antibiotiques (Llobet et al, 2015), il n'est pas exclu que nos conditions de culture diffèrent des conditions de culture d'autres laboratoires, inhibant ainsi l'expression de TBX2. Quoi qu'il en soit, nous avons utilisé plusieurs contrôles pour nous assurer de la spécificité des amorces et des anticorps
utilisés. La surexpression de TBX2 par transfection d'un plasmide codant TBX2 induit une surexpression des transcrits (non montré) et de la protéine. L'inhibition de TBX2 par transfection de siARN dirigés contre les transcrits TBX2 induit une diminution du taux d'ARN TBX2 (dans les cellules MCF-7) et de la protéine.
Pour déterminer si la surexpression des transcrits TBX2 dans les cellules SiHa traitées était dépendante de la méthylation du gène, le niveau de méthylation de TBX2 a été évalué sur deux zones (promoteur et exon 2) par séquençage de l'ADN converti au bisulfite de cellules SiHa traitées ou non ave 5 µM de 5azadC (non montré, Figure 26). La première zone est localisée au niveau du promoteur de TBX2 et d'un îlot CpG, et comprend 30 cytosines méthylables sur environ 370 pb. La matrice ADN a été amplifiée par PCR puis clonée dans un plasmide avant d'être séquencée. D'après le séquençage de 4 clones, la zone étudiée du promoteur est très largement non méthylée (deux cytosines dans un clone sur les quatre séquencés) dans les cellules SiHa non traitées. Cette absence de méthylation est étonnante vu la faible quantité de transcrits présents dans les cellules, ce qui suggère au contraire une forte méthylation du promoteur, et c'est pourquoi une deuxième zone a été étudiée. Elle n'est pas localisée sur un îlot CpG mais dans l'exon 2 du gène et comprend 13 cytosines méthylables. Une étude a été publiée avec des amorces ciblant cette zone sur de l'ADN converti au bisulfite et a montré que la méthylation d'une cytosine de cette zone était associée à la progression des cancers de la vessie (Kandimalla et al, 2012). Le séquençage a été effectué directement sur les produits de PCR, et révèle que 100% des cytosines des CpG séquencées (10/13) étaient méthylées. Les trois sites CpG non séquencés étaient situés aux extrémités des amplicons, ce qui rend le séquençage de Sanger inefficace ou imprécis. Après traitement des cellules avec le 5azadC, toutes les cytosines des CpG séquencées (10/13) étaient encore méthylées. Ce résultat est étonnant puisque le 5azadC inhibe toutes les DNMT catalysant cette marque épigénétique, suggérant que des zones du génome sont moins sensibles à la déméthylation que d'autres zones. Finalement, il n'est pas possible de conclure quant à l'implication de la déméthylation du gène TBX2 dans la surexpression des transcrits, lors du traitement des cellules SiHa avec le 5azadC. Afin de compléter ces résultats, il serait intéressant de connaître l'état de méthylation du gène TBX2 complet ainsi que de son environnement proche (par exemple les 8 îlots CpG présentés Figure 26) pour savoir si une partie du génome est effectivement déméthylée après traitement des cellules avec le 5azadC.
Figure 26 : Schéma du gène TBX2 humain.
Schéma représentant le gène TBX2 humain (en gris), avec les différents exons (boîtes grises Ex1 à Ex7) et les îlots CpG (CpG 1 à CpG 8) en noir. Sont placés sur le schéma les amorces (en violet) reconnaissant l'ADN
converti au bisulfite du promoteur de TBX2 (Promoteur sens et antisens) et de l'exon 2 (Exon2 sens et antisens). TBX2-AS1 (en vert, montré non complet) est le prochain gène en amont de TBX2, et C17orf82 (en
bleu) est le prochain gène en aval de TBX2. La séquence ADN est symbolisée par un double trait noir et représente une partie du chromosome 17 comprise entre les nucléotides n°61 394 987 et n°61 413 419. Le trait
en haut à gauche représente 1000 bases. Données tirées de NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)