Cristina Ochôa*1, Carlos Palmeira2, 3
1Departamento de Patologia, Laboratório Nacional de Investigação Veterinária, INRB-IP, 4485-655 Vairão VCD
2Serviço de Imunologia, IPOPFG, EPE, 4200-072 Porto
3Grupo de Patologia, Universidade Fernando Pessoa, 4200-150 Porto RPCV (2007) 102 (561-562) 53-59
53
Resumo: No gato, os sarcomas cutâneos apresentam comportamento biológico agressivo, recidivando frequentemente e
metastizando. Apesar das características histopatológicas de grande malignidade destes tumores, as alterações genómicas das células neoplásicas permanecem mal caracterizadas. Os estudos da ploidia de ADN fornecem informações mais precisas do comportamento biológico dos tumores e têm sido cada vez mais utilizados na obtenção de informação com validade prognóstica. Neste estudo avaliamos o conteúdo de ADN das células neoplásicas de 41 sarcomas dos tecidos moles do gato, através da técnica de citometria de imagem, com especial interesse na caracterização das seguintes variáveis citométricas:
ploidia de ADN, índice de ADN (IA) e percentagem de células com conteúdo de ADN superior a 2,5c, 5c e 9c. O acompanhamento clínico foi possível para 33 dos casos analisados,
tendo-se relacionado as variáveis citométricas com a sobrevida, na tentativa de avaliar a sua importância como factores de prognóstico. Os sarcomas felinos apresentaram aneuploidia de ADN em 34 neoplasias (82,9%) e o valor médio de IA foi de 1,5, notando-se frequentemente fracções celulares com conteúdos de ADN superiores a 5c e 9c. As variáveis citométricas
avaliadas não apontaram para associação significativa com a sobrevida, à excepção da variável citométrica fracção de células>2,5c, revelando prognóstico mais favorável para os gatos cujas neoplasias continham esta fracção elevada. Do presente trabalho resulta que as variáveis citométricas avaliadas têm baixa importância como factores de prognóstico, neste tipo de patologia. No entanto, os fenómenos de instabilidade genética podem estar relacionados com o comportamento biológico agressivo e desempenhar um papel importante na patogenia dos sarcomas felinos.
Palavras-chave: gato; sarcomas; factores de prognóstico;
conteúdo de ADN; ploidia de ADN
Summary: The soft tissue sarcomas in cats have aggressive biological behaviour with frequent recurrence and occurrence of metastases. Despite their malignant histopathological features, tumour cell genomic alterations remain poorly evaluated. Nuclear DNA content studies provide more accurate information about biological neoplasic behaviour and are relevant prognostic parameters in many tumour types. In this study,
41 feline soft tissue sarcomas have been evaluated by image cytometry, with particular interest for the following cytometric variables: DNA ploidy, DNA index (IA) and number of cells exceeding 2,5 c, 5c and 9 c. The follow-up was possible to determinate in 33 cats, in which the prognostic value of the aforementioned cytometric variables was tested. The feline sarcomas showed DNA aneuploidy in 34 (82,9%) of the analysed cases. The IA average was 1,5 and frequently there were cell fractions exceeding 5c and 9c. The cytometric variables have no significant prognostic value, except for the number of cells exceeding 2,5c, revealing better prognosis for cats with higher levels for this parameter. From this work it was concluded that cytometric variables have no significant
prognostic value, but genetic instability events could be related to aggressive biological behaviour and could take part in feline sarcomas pathogenesis.
Keywords: cat, sarcomas, prognostic factors, DNA content, DNA ploidy
Introdução
Classicamente a caracterização das neoplasias é realizada com base nas características citológicas e
histológicas. Contudo, à medida que novos conhecimentos emergem, novas técnicas são usadas para
apoiar o diagnóstico histológico, estabelecer o prognóstico e melhorar o conhecimento da história natural das neoplasias. A avaliação de anomalias cromossómicas torna-se particularmente útil no
diagnóstico dos sarcomas dos tecidos moles indiferenciados.
A citogenética constitui uma ferramenta
importante para o médico patologista, já que a maioria dos sarcomas dos tecidos moles contêm aberrações cromossómicas, muitas das quais
carac-R E V I S TA P O carac-R T U G U E S A
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
DE
*Correspondência: cristina.ochoa@lniv.min-agricultura.pt Ochôa C e Palmeira C RPCV (2007) 102 (561-562) 53-59
54
terísticas de alguns tipos histológicos. Infelizmente, a análise citogenética é laboriosa estando o seu sucesso dependente do êxito do citogeneticista em cultivar as células tumorais (Fletcher, 1995). Em Medicina
Veterinária a sua aplicação está limitada pela sua grande exigência, quer em recursos económicos, quer em meios técnicos. A técnica de citometria de
imagem, no entanto, permite a análise de material de arquivo, possibilitando ao operador uma monitorização activa na selecção das células e na rejeição de
artefactos (Pape et al., 1992; Mitchie et al., 1994), permitindo a caracterização da ploidia de ADN assim como desenvolver estudos retrospectivos que relacionam o tempo de sobrevida com os parâmetros avaliados na pesquisa de factores de prognóstico (Soini et al., 1992; Pape et al., 1992; Cattoretti et al., 1992; Baas et al., 1994; Clemo et al., 1994; Stenersen et al., 1994; Jösten e Rudolph, 1997; Subdo et al., 2001). Vários estudos de citometria de imagem e de fluxo encontraram associação entre a ploidia de ADN e o grau histológico (Pape et al., 1992; Clemo et
al., 1994; Böcking et al., 1994; van Velthoven et al., 1995b), a metastização (Lee et al., 1994), a
recorrência (Böcking et al., 1994; Lee et al., 1994) e a progressão da doença (Sazaki et al., 1992;
Zarbo, 1995; Subdo et al., 2002) em vários tipos de neoplasias.
No presente trabalho caracterizaram-se mais profundamente os sarcomas dos tecidos moles felinos
através da técnica de citometria de imagem
tentando--se ainda obter algumas informações sobre o acompanhamento clínico dos animais no sentido de
averiguar a importância dos parâmetros avaliados como factores de prognóstico.
Material e métodos
Neste trabalho estudaram-se 47 sarcomas dos tecidos moles de gatos, recorrendo a amostras incluídas em parafina, do arquivo histológico do Laboratório de Anatomia Patológica da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Técnica de Lisboa.
Foram efectuados cortes de 6 μm de espessura que foram depositados em lâminas revestidas por poli-L-lisina (Sigma). Procedeu-se à coloração de Feulgen utilizando-se o "kit" de coloração "CAS DNA" (Becton Dickinson, Cell Analysis System, Emhurst, III). Este "kit" de coloração utiliza a tionina para marcar especificamente o ADN nuclear,
produzindo uma coloração azul da cromatina. Esta marcação é feita de forma estequiométrica resultando numa intensidade de coloração proporcional à quantidade de ADN (Martinez-Nistal et al., 1993; Lee et al.,
1994; Cohen et al., 2001; Haroske et al., 2001).
Todo o procedimento foi realizado de acordo com as indicações do fabricante. Em cada banho de coloração foi incluída uma lâmina com hepatócitos de rato para calibração do citómetro de imagem e controlo externo da coloração. Após desparafinação e hidratação, as preparações histológicas, juntamente com uma lâmina de calibração, foram submetidas a hidrólise ácida numa solução de ácido clorídrico 5N (Merck) durante 60 minutos, sendo depois transferidas para a "solução de coloração" onde ficaram durante 60 minutos, após os quais foram submetidas a três passagens sucessivas pela "solução de lavagem". Seguiram-se a diferenciação em álcool ácido a 1%, desidratação e montagem
com Entellan® (Merck). As preparações histológicas foram guardadas ao abrigo da luz até posterior leitura (Oliveira et al., 2005).
Análise do conteúdo de ADN
A quantificação e interpretação dos resultados foram efectuadas no sistema de análise de imagem CAS 200® (Cell Analysis System, Inc., Elmhurst, III) através do programa "Quantitative DNA Analysis 3.0". Este programa permite medir o conteúdo de ADN nuclear em cortes de tecidos e estabelecer a correcção entre o conteúdo de ADN de um núcleo
individual e a espessura do corte. Uma vez quantificado, o conteúdo de ADN foi expresso em "unidades c"
(onde o "c" representa a quantidade de ADN de uma célula haplóide de cromossomas monocromatídicos).
A ploidia foi determinada como "ploidia de ADN"
para diferenciá-la claramente da contagem cromossómica obtida pelas técnicas de citogenética (Chieco e
Derenzini, 1999).
Após a calibração do aparelho com a lâmina
contendo hepatócitos de rato, procedeu-se à análise das preparações histológicas das neoplasias em estudo. Analisou-se em cada lâmina o valor médio do pico G0/G1 de um número mínimo de vinte linfócitos peritumorais. Os linfócitos funcionaram como controlo interno da ploidia de ADN, constituindo a população de células de referência para definir o pico G0/G1 diplóide de ADN (2c). A análise do conteúdo de ADN das células neoplásicas foi realizada através da leitura de um mínimo de cem núcleos bem focados e preservados, evitando-se os sobrepostos, destruídos ou
marginais (Bacus et al., 1993; van Velthoven et al., 1995a; Reeder et al., 1997; Oliveira et al., 2005).
Os resultados da análise de citometria de imagem foram apresentados sob a forma de histogramas de ADN, representando a distribuição da população celular em função da intensidade da coloração do ADN nuclear. Através da análise dos histogramas foram avaliados os seguintes parâmetros: a ploidia de ADN, índice de ADN (IA), percentagem de células com teor de ADN superior a 2,5c, 5c e 9c.
Na interpretação dos histogramas de ADN consideraram-se os consideraram-seguintes conceitos:
População de células de referência: população de células não neoplásicas com conteúdo de ADN
conhecido, funcionando como garantia de controlo e da reprodutibilidade da análise e permitindo estabelecer
Ochôa C e Palmeira C RPCV (2007) 102 (561-562) 53-59
55
o pico diplóide (Wied et al., 1989; Hardisson et al., 1993; Lee et al., 1994).
População diplóide (2c): população com conteúdo
de ADN considerado idêntico ao das células de referência para uma determinada espécie (Orfao et al.,
1993; Stöckle et al., 1993; Wheless et al., 1993; Lee et al., 1994).
População aneuplóide: população ou clone celular com conteúdo de ADN anormal, como tal, diferente da população celular diplóide de referência (Wheeless et al., 1993; Lee et al., 1994).
Para cada uma das neoplasias em estudo foi identificado o pico G0/G1 e calculados o IA, o desvio-padrão e o coeficiente de variação (CV).
O IA representa a razão entre o valor médio de conteúdo de ADN do pico G0/G1 da população de células em estudo e do pico G0/G1 das células de referência.
Definiu-se a região diplóide de ADN como o
conteúdo de ADN compreendido entre o valor médio do pico G0/G1 da população de referência ± 2 desvios-padrão (Oliveira et al., 2005). As neoplasias que apresentavam o pico G0/G1 compreendido nesta região foram classificadas como diplóides de ADN.
Por sua vez, aquelas cujos picos G0/G1 se localizavam fora desta região, foram classificadas como aneuplóides de ADN (Raju et al., 1993; Oliveira et al.,
2005). Os tumores que apresentaram histogramas de ADN com duas ou mais populações aneuplóides foram classificados como multiplóides.
O CV do pico G0/G1 da população de referência é uma medida de precisão que exprime a variabilidade da população celular estudada (Orfao et al., 1993; Lee et al., 1994) e serviu como controlo de qualidade dos estudos citométricos realizados.
Foram avaliadas também as percentagens de células com conteúdo de ADN superior a 2,5c, 5c e 9c. As células com conteúdo de ADN superior a 2,5c poderão corresponder a células em proliferação, enquanto que as células com valor de ADN superior a 5c indicam
muito possivelmente núcleos verdadeiramente aneuplóides.
A população de células com conteúdo de
ADN superior a 9c representa núcleos aneuplóides, muito aberrantes e com conteúdo de ADN muito elevado (Auer et al., 1980).
Estudo da sobrevida
Os animais em estudo foram sujeitos a excisão cirúrgica para extirpação do tumor primário, sem tratamento adicional. O seguimento clínico foi possível para 33 animais e a data do final do estudo foi 31 de Dezembro de 2002. Foram registadas as datas da cirurgia e a eventual data da morte natural ou por eutanásia através de contacto telefónico com o clínico veterinário assistente. Quando alguma destas informações não estava disponível, e sempre que possível,
foram contactados os proprietários dos animais. Os resultados ambíguos ou incompletos foram eliminados do estudo. Estas informações foram utilizadas para a determinação do parâmetro denominado tempo de sobrevida total (TST), definido pelo intervalo de tempo (em dias) desde a data da primeira excisão até à data da morte do animal ou à data final do estudo.
Análise estatística
Os resultados foram expressos em frequências
absolutas e relativas (percentagens) e para as variáveis numéricas foi calculada a mediana, valores mínimo e máximo, e utilizou-se a mediana como valor "cut off".
A sobrevida global foi calculada pelo método de Kaplan-Meyer. As variáveis citométricas foram categorizadas em dois grupos e relacionadas com o TST. Foram calculadas as medianas do TST para cada uma das categorias, e as diferenças entre os grupos foram comparadas pelo teste de log-rank, com o
objectivo de estudar a sua importância como possíveis factores de prognóstico.
As associações encontradas foram consideradas significativas para valores de p<0,05.
Resultados
Das 47 neoplasias examinadas não foi possível a caracterização citométrica de 6 casos, devido à
sobreposição excessiva dos núcleos ou a condições de fixação deficientes, pelo que o estudo das variáveis citométricas ficou limitado a 41 neoplasias.
Ploidia de ADN
Observou-se aneuploidia em 34 (82,9%) das neoplasias estudadas. Apenas 7 sarcomas (17,1%) da amostra deste estudo apresentaram conteúdo de ADN diplóide. Dentro da categoria dos
tumores aneuplóides, 11 neoplasias destacaram-se
pela presença de clones múltiplos, tendo sido considerados multiplóides (Tabela 1). As Figuras 1, 2 e 3
representam histogramas obtidos duma neoplasia com conteúdo diplóide, aneuplóide e multiplóide de ADN, respectivamente.
N.º de núcleos
Figura 1 - Histograma diplóide de ADN Conteúdo de ADN (picogramas)
Ochôa C e Palmeira C RPCV (2007) 102 (561-562) 53-59
56
Índice de ADN (IA)
O valor mediano de IA dos sarcomas foi de 1,5 (mínimo-1,03, máximo- 2,17). Para efeitos de comparação
com as variáveis patológicas, utilizou-se este valor como "cut off" para definir os intervalos de baixo (<1,5) e alto (≥1,5) IA. Dos sarcomas analisados, 58,5%
apresentaram IA alto e 41,5% IA baixo (Tabela 1).
Fracção de células com conteúdo superior a 2,5c, 5c e 9c
Cada uma destas variáveis foi categorizada em dois subgrupos utilizando-se o valor da mediana como valor "cut off", como sumariado na Tabela 1.