Este estudo foi limitado aos 33 animais cujo seguimento clínico foi possível.
Para comparação das variáveis citométricas com os tempos de sobrevida, categorizou-se em dois grupos a variável ploidia de ADN: diplóides de ADN e aneuplóides de ADN.
Foi possível observar associação estatística significativa para a variável citométrica "fracção de células
>2,5c" (p=0,01), revelando prognóstico mais favorável os gatos cujas neoplasias continham esta fracção elevada. As outras variáveis citométricas avaliadas não
Figura 2 - Histograma aneuplóide de ADN Figura 3 - Histograma multiplóide deADN N.º de núcleos
N.º de núcleos
Conteúdo de ADN (picogramas) Conteúdo de ADN (picogramas) Tabela 1 - Variáveis citométricas observadas
Variáveis citométricas: n % Ploidia de ADN Diplóide 7 17,1 Aneuplóide 23 56,1
Multiplóide 11 26,8
Índice de ADN Baixo 17 41,5 Elevado 24 58,5
Fracção de células com conteúdo de ADN >2,5c Baixo 18 43,9 Elevado 23 56,1
>5c Baixo 23 56,1 Elevado 18 43,9
>9c Baixo 20 70,7 Elevado 12 29,3
Tabela 2 - Características citométricas das neoplasias e análise univariada com os tempos de sobrevida total de 33 gatos
Variáveis N.º gatos (%) TST (dias) (Mediana) p (log rank) Ploidia de ADN Diplóide 5 (15,2) 248 0,33
Aneuplóides 28 (84,2) 351
Índice de ADN Baixo 13 (39,4) 248 0,42 Alto 20 (60,6) 351
>2,5c Baixo 13 (51,5) 231 0,01*
Alto 20 (60,6) 456
>5c Baixo 17 (51,5) 244 0,11 Alto 16 (48,5) 379
>9c Baixo 23 (69,7) 334 0,27 Alto 10 (30,3) 437
* Valor estatisticamente significativo. TST: Tempo de sobrevida total.
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revelaram associação significativa com a sobrevida, ou seja, não se registou uma diferença estatisticamente significativa da sobrevida total entre as neoplasias com conteúdo diplóide e as aneuplóides. No entanto, observou-se uma tendência para que os grupos de gatos com neoplasias aneuplóides de ADN ou
fracções elevadas de células com conteúdo >5c e >9c, revelassem valores superiores de mediana para o tempo de sobrevida (Tabela 2).
Discussão
A instabilidade genética é uma das características das células neoplásicas e a expressão gradual de alterações génicas com aumento da malignidade histológica tem sido implicada na carcinogénese (Hollstein et al., 1991; Böcking et al., 1994; Pihan e Doxsey, 1999; Plaja et al., 2001; Krishnamurthy e Sneige, 2002). A maioria das neoplasias sólidas exibe aberrações cromossómicas, sugestivas de aneuploidia e mesmo as células diploídes de ADN mostram
frequentemente desarranjos no emparelhamento de cromossomas (Auer et al., 1989; Loeb, 1991; Turker, 1998). A quantidade de ADN nuclear pode ser modificada pelos seguintes mecanismos: replicação,
poliploidização, ganho ou delecção. Cada um destes eventos provoca alterações nas dimensões e no número de cromossomas (Böcking et al., 1994;
Enchev, 1998).
No presente estudo, 82,9 % dos sarcomas analisados apresentaram conteúdo de ADN aneuplóide e apenas 17,1 % eram diplóides de ADN e o índice de ADN (IA) variou entre 1,03 e 2,17. O facto de que a maioria
dos sarcomas estudados apresentaram aneuploidia de ADN pode reflectir-se no comportamento biológico agressivo destas neoplasias e sugerir que possam estar envolvidos no processo de carcinógenese fenómenos de instabilidade genética com repercussões nas alterações cromossómicas numéricas, evento já descrito na literatura (Duesberg, 1999). A aneuploidia de ADN é o parâmetro citométrico equivalente da aneuploidia cromossómica avaliada pela citogenética e serve de marcador neoplásico, reflectindo alterações genómicas de larga escala devidas à instabilidade genética e servindo de marcador de prognóstico para neoplasias de muitos tipos (Haroske et al., 2001). As alterações genéticas progressivas podem induzir propriedades fenotípicas associadas à malignidade,
tais como rápido crescimento e capacidade de metastização (Auer et al., 1989; Shackney e Shankey, 1997).
Lesões aneuplóides têm tendência a corresponder a células menos diferenciadas (Nenning et al., 1997). As neoplasias multiplóides de ADN estão associadas a comportamento biológico mais agressivo em alguns tipos de tumores (Lorenzato et al., 2000; Subdo et al., 2001).
A detecção de células aneuplóides >5c e >9c é
importante por poderem ser marcadores de instabilidade e agressividade das neoplasias de tecidos onde
não se dá o fenómeno de poliploidia fisiológica (Böcking et al., 1994; van Velthoven et al., 1995b;
Lorenzato et al., 2000; Subdo et al., 2002). Vários estudos encontraram correlação entre o número de células >5c e o grau citológico / histológico (Siitonen et al., 1993; Schapers et al., 1993; van Velthoven et al., 1995a), o estadio (Schapers et al., 1993; Nenning et al., 1997) e a progressão da doença (Schapers et al., 1993), nomeadamente para os sarcomas humanos (Mitchie et al., 1994).
A importância no prognóstico das variáveis
citométricas nos sarcomas dos tecidos moles é controversa (Calonje e Fletcher, 1995). No nosso estudo não
foi observada uma diferença significativa entre a sobrevida dos gatos que apresentaram tumores diplóides e os aneuplóides. Por outro lado os sarcomas aneuplóides, normalmente descritos como os mais agressivos, apresentaram valores ligeiramente
superiores de TST. Outros estudos em alguns tipos de sarcomas como os rabdomiossarcomas, encontraram resultados semelhantes, ou seja, os casos hiperdiplóides com maior sobrevida aos 5 anos,
quando comparados com os casos diplóides (De Zen et al., 1997; Pohar-Marinsek et al., 2003). Muitas das neoplasias aqui classificadas como diplóides poderão conter alterações genéticas abaixo do limite da resolução da citometria de imagem, apenas detectadas por técnicas mais sensíveis como o FISH ou o PCR.
As outras variáveis citométricas avaliadas não apresentaram associação significativa com a sobrevida,
revelando, de forma inesperada, valores de mediana para tempos de sobrevida superiores nos grupos de gatos com neoplasias com fracções elevadas de células com conteúdo de ADN superior a 5c e 9c, ao contrário de vários estudos prévios, que associaram estes parâmetros a comportamento biológico agressivo (Schapers et al., 1993; Siitonen et al., 1993; Epp et al., 1996; Lorenzato et al., 2000; Subdo et al., 2002). Num estudo de sarcomas dos tecidos moles humanos, com número idêntico de casos, foi possível correlacionar a progressão da doença com a ploidia de ADN, IA e fracções >2,5c e >5c, indicando a técnica de citometria de imagem como instrumento importante na obtenção de indicadores de prognóstico válidos para os sarcomas dos tecidos moles para além dos meios convencionais (Mitchie et al., 1994). A
citometria de imagem, apesar da vantagem de permitir seleccionar as células morfologicamente, evitando artefactos e células não tumorais, apresenta limite de resolução para detectar pequenas alterações no conteúdo de ADN como translocações, pequenas amplificações ou mutações, sendo necessário estudos com maior amostragem para precisar a importância da ploidia de ADN como factor de prognóstico para os sarcomas do gato.
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Bibliografia
Auer G, Askensen U, Ahrens O (1989). Cytophotometry.
Hum Pathol, 20(6): 518-527.
Auer GU, Casperson TO, Wallgren AS (1980). DNA Content and Suvival in Mammary Carcinoma. Anal Quant Cytol, 2: 161-165.
Baas IO, Mulder J-WR, Offerhaus JA, Vogelstein B, Hamilton SR (1994). A Evaluation of Six Antibodies for Immunohistochemistry of Mutant p53 Gene Product in archival Colorectal Neoplasms. J Pathol, 172: 5-12.
Bacus SS, Bacus JW, Bacus JV, Bacus BC, Chin DM, Ortiz R, Stern RK, Morrow DW (1993). Prostate Adenocarcinoma:
an Image Analysis Technique for DNA Ploidy Determination. Lab Med, 24(4): 225-331.
Böcking A, Striepecke E, Auer H, Füzesi L (1994). Static DNA Cytometry. Biological Background, Technique and Diagnostic Interpretation. In Compendium on the Computerized Cytology and Histology Laboratory. Eds.
Wied, G.L.; Bartels, P.H.; Rosenthal, D.L.; Schen, C.K.
Tutorials of Cytology, 107-138.
Calonje E, Fletcher CDM (1995). Immunohistochemistry and DNA Flow Cytometry in Soft-Tissue Sarcomas.
Hematol Oncol Clin North Am, 9(3): 657-675.
Cattoretti G, Becker MHG, Key G, Duchrow M, Schlüter C, Galle J, Gerdes J (1992). Monoclonal Antibodies against Recombinant Parts of the Ki-67 Antigen (MIB-1 and MIB-3) Detect Proliferating Cells in Microwaveprocessed Formalin-Fixed paraffin Sections. J Pathol,
168: 357-363.
Chieco P, Derenzini M (1999). The Feulgen Reaction 75 Years on. Histochem Cell Biol, 111: 345-358.
Clemo F, DeNicola DB, Carlton W, Morrison W, Walker E (1994). Flow Cytometric DNA Ploidy Analysis in Canine Transitional Cell Carcinoma of Urinary Bladders. Vet Pathol, 31: 207-215.
Cohen M, Wright JC, Brawner WR, Smith AN, Henderson R, Behrend EN (2001). Use Of Surgery And Electron Beam Irradiation, With Or Without Chemotherapy, For Treatment Of Vaccine-Associatede Sarcomas In Cats:
78 Cases (1996-2000). J Am Vet Med Assoc, 219(11):
1582-1589.
De Zen L, Sommaggio A, dÁmore ES, Masiero L, di Montezemolo LC, Linari A, Madon E, Dominici C, Bosco S, Bisogno G, Carli MM, Ninfo V, Basso G (1997).
Clinical relevance of DNA ploidy and proliferative activity in childhood rhabdomyosarcoma: a retrospective analysis of patients enrolled onto the Italian Cooperative
Rhabdomyosarcoma study RMS88. J Clin Oncol1, 5(3):
1198-1205.
Duesberg P (1999). Are centrossomes or Aneuploidy the key to cancer? Science, 284: 2091-2092.
Enchev V (1998). DNA Ploidy and Morphometric Features of Normal, Hiperplastic, Premalignant and Malignant Specimens. An Evaluation. Anal Quant Cytol Histol, 20(4): 288-296.
Epp RA, Justice WM, Garcia FV, McGregon DH, Giri SPG, Kimler F (1996). Retrospective DNA Ploidy Analysis by Image and Flow Cytometry in head and Neck Cancer.
Laryngoscope, 106: 1306-1313.
Fletcher CDM (1995). Cytogenetic anlysis of soft tissue tumours. In Soft Tissue Tumors (Eds) Enzinger FM, Weiss SW. St Louis. Mosby, 105.
Hardisson D, Salto M, Salas A, Toyos JR, Sampedro A (1993). "Preparation of Samples for DNA Image Cytometry" In: DNA Cytometric Analysis. Eds.
Sampedro A.; Orfao, A. Universidad de Oviedo - Serviço de publicações, 71-87.
Haroske G, Baak JP, Danielsen H, Giroud F, Gschwendtner A, Oberrholzer M, Reith A, Spieler P, Böcking A (2001).
Fourth updated ESACP consensus report on diagnostic DNA image cytometry. Anal Cell Pathol, 23: 89-95.
Hollstein M, Sidransky D, Vogelstein B, Harris CC (1991).
Mutations in Human Cancers. Science, 253: 49-53.
Krishnamurthy S, Sneige N (2002). Molecular and Biologic Markers of Premalignant Lesion of Human Breast. Adv Anat Pathol, 9(3): 185-197.
Lee S, Tolmachoff T, Marchevesky AM (1994). DNA Content Analysis Image Analysis. Applications and Comparison with Flow Cytometry. Image Analysis: a Primer for Pathologists. Eds. Marchevvsky A.M. E Bartels P.H. Raven Press, Ltd, 261-307.
Loeb LA (1991) Mutator Phenotiype maybe required for Multistage Carcinogenesis. Cancer Res, 51: 3075-3079.
Lorenzato M, Abboud P, Masure M, Bouthens D, Visseux-Coletto B, Quereux C , Adnet J-J (2000). Image
Cytometry Detection of Breast Cancer Cells with >5c DNA Content and Minor DNA Stemlines. Anal Quant Cytol Histol, 22(3): 199-205.
Martinez-Nistal A, Hardisson D, Gonzalez A, Barriuso J, Sampedro A (1993). "Physical and Instrumental Bases of DNA Image Cytometry." In: DNA Cytometric Analysis.
Eds. Sampedro A.; Orfao, A. Universidad de Oviedo -Serviço de publicações, 25-53.
Mitchie BA, Black C, Reid RP, Barret A, Hamblen DL (1994). Image Analysis Derived Ploidy and Proliferation Indices in Soft Tissue Sarcomas: Comparison with Clinical Outcome. J Clin Pathol, 47: 443-447.
Nenning H, Rabler J, Minh DH, Atolsenburg J-U (1997).
The Value of DNA Cytometry in Transitional Cell Carcinoma of the Urinary Bladder. Gen Diagn Pathol, 143: 231-236.
Oliveira PA, Palmeira C, Lourenço LM, Lopes CA (2005).
Evaluation of DNA Content in Preneoplastic Changes of Mouse Urinary Bladder Induced by
N-Butyl-N-(4-hydroxybutyl) Nitrosamine. J Exp Clin Cancer Res, 24(4): 609-616.
Orfao A, Gonzalez M, Lopez-Berges C, Lopez A, Vidrialis B, Macedo A, Miguel JFS (1993). "Cell Cycle ans DNA aneuploidy: Biological Bases and Terminology." In: DNA Cytometric Analysis. Eds. Sampedro A.; Orfao, A.
Universidad de Oviedo - Serviço de publications, 15-23.
Pape H, Pöttgen Ch, Ploem JS, Van Driel-Kulker A, Wurm R, Schmitt G (1992). The Prognostic Value of DNA Content Measure by Cytometry in Soft Tissue Sarcomas.
Ann Oncol 3, (Suppl. 2) S89-S92.
Pihan GA, Doxsey SJ (1999). The Mitotic Machinery as a Sourse of Genetic Instability in Cancer. Semin Cancer Biol, 9: 289-302.
Plaja A, Perez C, Miró R (2001). Chromossome Aneuploidy and Cancer: Lessons from a Chromossomal Instability Síndrome. Cancer Genet Cytogenet, 131: 144-145.
Pohar-Marinsek Z, Bracko M, Lavrencak J, Us-Krasovec M
(2003). DNA ploidy as a prognostic factor in rhabdomyosarcoma.
Analysis of 35 cases with image cytometry.
Anal Quant Cytol, 25(4): 235-242.
Ochôa C e Palmeira C RPCV (2007) 102 (561-562) 53-59
59
Raju U, Zarbo R, Kubus J, Schuktz (1993). The Histologic Spectrum of Apocrine Breast Proliferations: a
Comparative Study of Morphology and DNA Content by Image Analysis. Hum Pathol, 24(2): 173-181.
Reeder DH, Cox C, Wheeless LL, Flint A, Liebert M, Grossman HB (1997). Variability of DNA Analysis by Image Cytometry. Cytometry, 28: 176-180.
Schapers RFM, Ploem-Zaaijer JJ, pauwels RP, Smeets WGB, van den Brandt PA, Tanke HJ, Bosman FT (1993).
Image Cytometric DNA Analysis in Transitional Cell Carcinoma of the Bladder. Cancer, 72(1): 182-189.
Shankey SE, Shankey TU (1997). Common Patterns of Genetic Evolution in Human Solid Tumors. Cytometry, 29: 1-27.
Siitonen SW, Kallioniemi O-P, Helin HJ, Isola J (1993).
Prognostic Value Of Cells With More Than 5c DNA Content in Node-Negative Breast Cancer As Determined By Image Cytometry From Tissue Sections. Hum Pathol, 24(2): 1348-1353.
Soini Y, Vahakangas K, Kyosti N, Kamel D, Lane DP, Paakko P (1992). P53 Immunohistochemistry in
Malignant Fibrous Histiocytomas and Other Mesenchimal Tumours. J Pathol, 168: 29-33.
Stenersen TC, Danielsen H, Farrants G, Reith A (1994).
Caveats in the use of archival cell material for DNA analysis by image cytometry. Anal Cell Pathol, 7:
217-233.
Stöckle M, Steinbach F, Voges G, Hohenfellner R (1993).
Image analysis DNA Cytometry of Bladder Cancer.
Recent Results Cancer Res, 22: 151-163.
Subdo J, Bryne M, Johannessen AC, Kidal W, Danielsen HE, Reith A (2001). Comparison of Histological Grading and Large-Scale Genomic Status (DNA Ploidy) as Prognostic Tools in Oral Dysplasia. J Pathol, 194: 303-310.
Subdo J, Kidal W, Johannessen AC, Koppang HS, Subdo A, Danielsen HE, Risberg B, Reith A (2002). Gross
Genomic Aberrations in Precancers: Clinical Implications of a long-term Follow-up Study in Oral Erythroplakias. J Clin Oncol, 20: 456-462.
Turker MS (1998). Estimation of Mutation Frequencies in Normal Mammalian Cells and the Development of Cancer. Semin Cancer Biol, 8: 407-419.
van Velthoven R, Petein M, Oosterlinck WJ, Roches H, Pasteels JJ, Schulman C, Kiss R (1995a). The Use of Digital Image Analysis of Chromatin Texture in Feulgen-Stained Nuclei to Predict Recurrence of Low Grade Superficial Transitional Cell Carcinoma of the Bladder.
Cancer, 75(2): 560-568.
van Velthoven R, Petein M, Oosterlinck WJ, Zandona C, Zlotta A, van der Meijden PJ-L, Roels H, Schulman C, Kiss R (1995b). Image Cytometry Determination of Ploidy Level, Proliferative Activity, and Nuclear Size in a Serie of 314 Transitional Bladder Cell Carcinomas. Hum Pathol, 16: 3-11.
Wheeless LL, Badalament RA, deVere White RW, Fradet Y, Tribukait B (1993). Consensus Review of the Clinical Utility of DNA Cytometry in Bladder Cancer. Cytometry, 14: 478-481.
Wied GL, Bartels PH, Bibbo M, Dytch HE (1989). Image Analysis in Quantitative Cytopathology and Histopahology.
Hum Pathol, 20(6): 549-571.
Zarbo RJ (1995). DNA Analysis of Soft Tissue Tumors. In:
Soft Tissue Tumors. 3rd Ed. Enzinger, F.M.; Weiss, S.W.
Mosby-Year Book, Inc.St Louis. Missouri, USA.