2. Méthode de segmentation des neurones
2.1. Etat de l’art
2.1.2. Validation des méthodes de segmentation d’objets
Comptage d’objets
Pour estimer la performance d’une méthode automatique, He et al. (2015) ont calculé l'exactitude de la méthode en terme de nombre de cellules correctement segmentées. Dans leur évaluation, une cellule segmentée automatiquement correspond à une cellule marquée manuellement par un expert si la distance entre les centroïdes de ces deux cellules est inférieure à un rayon de cellule R prédéfini. Alors, les cellules segmentées automatiquement et marquées manuellement forment une paire unique. Par la suite, le nombre de cellules marquées manuellement sera noté Ng, le nombre de
cellules segmentées automatiquement sera noté Nd et le nombre de cellules segmentées qui font
partie d’une paire unique sera noté Nm. La performance de la méthode est calculée selon trois
critères : le rappel (R), la précision (P), et le F-score (F) donnés par les équations (1).
P
R
P
R
F
N
N
P
N
N
R
d m g m
;
;
2
(1)De nombreux chercheurs (Al-Kofahi et al., 2010; Shu et al., 2013; Zhang et al., 2013; Poulain et al., 2015; Kainz et al., 2015; Molnar et al., 2016) ont évalué la performance de leur méthode en utilisant les mêmes critères. En plus de ces trois critères, Kothari et al. (2009) ont également évalué le pourcentage d’erreur, donné par l’équation (2).
%
100
g g dN
N
N
(2)40 Stéréologie
Dans le domaine des neurosciences, la stéréologie est un outil très largement utilisé pour estimer des informations quantitatives telles que le nombre d’objets, leur longueur ou leur volume. Ces mesures sont généralement réalisées pour une région anatomique tridimensionnelle selon une procédure d’échantillonnage non biaisée à partir de sections transversales de tissus espacées régulièrement. La procédure d’échantillonnage systématique doit être soigneusement définie à l’avance afin d’éviter les biais. A un échantillonnage donné correspond une précision de la mesure qui peut être estimée. De très nombreuses études ont été réalisées en utilisant la stéréologie pour caractériser le nombre de neurones dans les cerveaux de plusieurs espèces animales (Gundersen, 1986; West et al., 1991; Mayhew, 1992 ; Jelsing et al., 2006). Etonnamment, nous n’avons pas trouvé, dans la littérature, de validation des méthodes de segmentation ou d’individualisation d’objets basée sur la stéréologie. Cette technique étant une méthode de référence pour la caractérisation et le comptage d’objets biologiques, il nous a paru très pertinent de la considérer pour valider notre méthode d’individualisation des neurones.
La Figure 32 illustre un schéma d’échantillonnage systématique d’une coupe de l’hippocampe de rat (West et al., 1991).
Figure 32 : Schéma d'échantillonnage systématique. (a) L'hippocampe de rat est coupé dans le plan horizontal. (b) La première section de la série à analyser (astérisque *) est choisie aléatoirement parmi les 12 premières sections. Cette section et chaque 12ème section par la suite est colorée pour l'analyse suivante. La fraction de section d'échantillonnage, ssf, est donc 1/12. (c) Les coupes histologiques sont étudiées grâce à un microscope couplé à une caméra et à un système de déplacement pas à pas en x, y et t. A l’image de la coupe histologique est superposée une trame de comptage définie par des dissecteurs optiques de taille fixe et de distribution régulière. La fraction de surface d'échantillonnage, asf=a(cadre)/a(x,y,pas), est la surface de dissecteur optique par rapport à la surface de l’élément de la trame où est placé le dissecteur. La fraction d'épaisseur d'échantillonnage, hsf, est la hauteur h de l'échantillon du dissecteur par rapport à l'épaisseur de la section, h/t. Le nombre de neurones dans une section peut être calculé selon l’équation 3.
Dans ce cas, l’hippocampe de rat est coupé dans le plan horizontal. Les coupes obtenues sont divisées sous la forme de séries entrelacées (s) qui peuvent être colorées par différents marquages pour les différentes analyses biologiques à mener. Ensuite, dans les coupes contenant la région hippocampique, une coupe de la première série est choisie aléatoirement. Cette coupe et chaque sème coupe sont ensuite sélectionnées pour l’analyse suivante. La fraction de section d’échantillonnage, ssf, est donc de 1/s. Dans chacune des coupes, la région à étudier est segmentée
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manuellement et à l’intérieur de celle-ci, des dissecteurs optiques (sondes 3D invariantes par la taille, la forme ou l’orientation) sont générés avec une taille et des pas x, y prédéfinis. Ensuite, les neurones qui se trouvent à l’intérieur de dissecteur optique (cadre de comptage) sont comptés avec une règle d’exclusion de tous les neurones touchant les lignes rouges (Figure 32). La fraction de surface d’échantillonnage, asf, est donc la surface du cadre de comptage, a(cadre), par rapport à la surface de l’élément de la trame où est placé le dissecteur, a(x,y,pas). La fraction d’épaisseur d’échantillonnage, hsf, correspond à l’épaisseur du dissecteur h, divisée par l’épaisseur de la coupe t. Le nombre de neurones dans la région d’intérêt de la série correspondante est estimé par l’équation 3.
Q
hsf
asf
ssf
N
total1
1
1
(3)Où
Q
est le nombre total de neurones effectivement comptés dans les dissecteurs.Dans la section 2.4.6.3, nous allons utiliser la stéréologie afin de valider notre méthode d’individualisation et de comptage des neurones. Grâce à la stéréologie, il est possible d’estimer de manière non biaisée le nombre de neurones dans une structure anatomique ce qui donnera un critère objectif pour évaluer notre méthode de comptage.
Pour conclure cette partie, force est de constater que les critères de validation des méthodes d’individualisation sont relativement limités voire même pourraient être mis en défaut par exemple si l’on venait à prendre en compte les contours ou la forme réelle des objets définis après individualisation. Ce point sera abordé plus précisément dans la suite de notre travail.