Imagerie des coupes histologiques

Les coupes histologiques une fois produites sont soit observées directement sous un microscope soit numérisées de différentes manières en fonction des informations d’intérêt recherchées. Si une résolution de l’ordre de quelques micromètres à quelques dizaines de micromètres est nécessaire, l’utilisation d’un scanner à plat est suffisante. Par contre, si une résolution inférieure ou égale au micromètre est nécessaire, il est alors obligatoire d’utiliser un microscope ou un scanner de lame qui est proche par construction d’un microscope standard mais qui intègre en plus des mécanismes permettant d’automatiser la numérisation de série de coupes (déplacement des lames, numérisation de mosaïques, etc.). Pour numériser des coupes entières (WSI – Whole Slide Imaging), MIRCen s’est équipé d’un scanner de lames WSI Axio Scan Z.1 (Carl Zeiss Microscopy GmbH Iéna, Allemagne) (Figure 24). La plupart des grandes campagnes de numérisation de coupes à MIRCen sont réalisées avec ce système car il dispose d’un automate qui permet de lancer la numérisation de 50 grandes lames de verre au sein d’une même session. Ce système de microscopie automatisé fournit aux chercheurs des numérisations des coupes en champ clair et en fluorescence. Dans notre cas, l’Axio Scan Z.1 peut numériser des coupes aux grossissements x2.5, x5, x10, x20, x40 ce qui correspond à des résolutions de respectivement 1,76 µm, 0,88 µm, 0,44 µm, 0,22 µm et 0,11 µm en deux dimensions dans le plan d’acquisition. L’augmentation de la résolution augmente la durée de numérisation et la taille des images. En considérant la taille des neurones du cerveau de macaque, nous avons choisis un grossissement x20 qui est utilisé couramment dans ce type d’étude. Le temps de numérisation d’une coupe à la résolution de 0,22 µm est de quelques heures.

Figure 24 : Scanner de lames Axio Scan Z.1 à gauche, interface graphique du logiciel de microscopie à droite.

Les coupes numérisées sont ensuite gérées et traitées par le logiciel ZEN de Zeiss qui permet de piloter le scanner et de sauvegarder les images au format propriétaire CZI (Carl Zeiss Imaging). Il est également possible d’exporter des images de plus basse résolution aux formats TIFF, JPEG, PNG et GIF. Différentes stratégies d’acquisition sont possibles avec ce système : acquisition d’un plan unique (mise au point de la netteté sur un plan pré-calculé à partir de points de mesure), acquisition en plan unique avec l'algorithme unsharp masking pour augmenter la netteté de l’image, acquisition en pile

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appelée « Z-stack » et acquisition en pile Z avec l’utilisation a posteriori d’un algorithme permettant de calculer la mise au point optimale entre le jeu de coupes acquises ce qui permet d’améliorer localement la netteté des images produites avec en contrepartie un temps d’acquisition, un volume de données et des temps de calcul beaucoup plus importants (profondeur de champ étendu: EDF, extended depth of focus)

Source:

https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen/image-acquisition.html Description des principaux modes de numérisation à disposition :

 acquisition en plan unique (Figure 25a)

C'est la méthode d'acquisition la plus simple basée sur une mosaïque de tuiles. L'épaisseur de coupe que nous avons utilisée est de 40 µm ce qui est standard pour l’histologie produite chez le primate. L’Axio Scan Z.1 fait tout d’abord une mise au point grossière, à un grossissement plus faible que celui utilisé pour la numérisation, selon une stratégie d’échantillonnage définie par l’utilisateur en fonction de la pièce de tissu à numériser (positionnement automatique de points de focus répartis sur l’ensemble du tissu, ici stratégie en « peau d’oignon » avec un maximum de 25 points de focus). Ceci permet de trouver un plan optimal dans le tissu qui servira de point de départ pour une mise au point plus fine. Cette mise au point fine est réalisée au grossissement utilisé pour la numérisation sur un échantillonnage adapté de tuiles (ici, 1 tuile sur 5, le plan focal optimal de la première tuile étant appliqué aux 4 tuiles suivantes). Ces deux étapes de mise au point permettent d’établir automatiquement des cartes de mise au point utilisées par le scanner pour la numérisation finale.

 acquisition en plan unique avec l'algorithme unsharp masking (Figure 25b)

Cette méthode applique la technique de filtrage passe-haut (masque unsharp) qui amplifie les informations de haute fréquence dans une image afin d’améliorer la netteté de l’image. L’image originale est d’abord dupliquée et ensuite filtrée par un noyau gaussien. Le masque unsharp est défini par la différence entre les valeurs de l’image originale et celles du duplicata filtré. L’addition du masque unsharp et de l’image originale construit la nouvelle image dans laquelle les détails (les informations de haute fréquence) sont renforcés.

 acquisition en mode Z-stack (Figure 25d-f)

L’acquisition en mode Z-stack permet d'acquérir des piles d'images axiales avec le microscope Zeiss selon la direction de la profondeur de la coupe. Le programme d'acquisition d'image commence par le plan central, ensuite autour de ce plan, des acquisitions sont réalisées de part et d’autre avec un pas d’échantillonnage fixé par l’opérateur (généralement de l’ordre de 1 micromètre). Pour chaque plan, une mise au point spécifique est réalisée, le nombre de coupes peut atteindre 20, le résultat est un pseudo-volume.

 acquisition en pile Z combinée avec l'algorithme EDF (Figure 25c)

Le logiciel ZEN peut traiter la pile de coupes acquises en mode Z-stack après la numérisation avec un algorithme de calcul d’une profondeur de champ étendue. Ce module extrait des détails nets sur un plan à partir d'images existantes à différentes positions de focalisation en Z et les combine pour créer une nouvelle image. Avec cette méthode, nous pouvons avoir une image dans un plan unique avec un focus optimal calculé à travers la profondeur numérisée de la coupe même pour les échantillons épais.

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En utilisant le logiciel ZEN, de grandes données peuvent être numérisées et analysées. Il propose de plus un outil de visualisation performant qui permet de naviguer dans les images à différentes résolutions ce qui permet de zoomer facilement dans toutes les régions d’intérêt de la coupe du cerveau. Il permet également d’ajuster le contraste et d’accéder à des caractéristiques morphologiques basiques (diamètre, surface, etc.) des neurones.

Figure 25 : Visualisation des images acquises, au grossissement x20, en plan unique (a), en plan unique avec l’algorithme unsharp masking (b), en pile Z puis traité avec l’algorithme d’EDF (c) et en pile Z (d-f). La coupe épaisse acquise en pile Z est divisée en 11 plans, les images montrées dans cet exemple sont les 1ère (d), 6ème (e) et 11ème (f).

La résolution des images numérisées est de 0,22 µm/pixel dans le plan d’acquisition X/Y au grossissement x20. Pour mon travail, les coupes histologiques de cerveau de macaque ont été numérisées avec cette résolution, la coupe la plus grande correspond à peu près à 150 Go pour une dimension de centaines de milliers par des centaines de milliers pixels.