1. Contexte
1.4. Problématique liée à l’étude des neurones en microscopie optique
Les maladies neurodégénératives présentées dans la partie 1.1.4.2 conduisent à la mort de nombreuses personnes dans le monde et restent pour la plupart incurables aujourd’hui encore. Des phénomènes communs à ces maladies sont l’atrophie du cerveau à l’échelle macroscopique et la perte de neurones au niveau microscopique. Pour mieux comprendre le fonctionnement des organes sains, ainsi que les mécanismes impliqués dans les maladies neurodégénératives, l’étude précise du nombre, de la morphologie et de la distribution des neurones dans chaque région anatomique du cerveau constitue un défi majeur à relever.
MIRCen possède une grande expertise dans le domaine des maladies neurodégénératives. Un certain nombre de laboratoires incluant histologie, biochimie, virologie, imagerie et une équipe traitement de l’image se consacrent à évaluer des thérapies innovantes à l’aide d’un ensemble de plateformes dédiées au développement de modèles animaux pertinents de pathologies humaines.
Dans ce contexte, mon projet de thèse consiste à étudier les neurones marqués par immunohistochimie à l’aide de l’anticorps NeuN sur des coupes histologiques de cerveau de macaque sain. Ces travaux sont basés sur des méthodes de traitement de l’image développées dans notre laboratoire dans le domaine de la segmentation de l’image. Toutefois, dans ce contexte, il subsiste un nombre important de problèmes à résoudre :
1. Un cerveau entier de macaque est très grand (52360 mm3 en moyenne pour les macaques) comparé à celui de rongeurs (994 mm3 en moyenne pour les rats) (Chareyron et al., 2011). De plus, les régions anatomiques peuvent être nombreuses sur une seule coupe. Les différents types de neurones ainsi que leur distribution sont très variables. Cela se traduit par une grande variabilité de l’intensité de coloration des neurones (Figure 28) rendant difficile la séparation des neurones marqués, du tissu non marqué.
32
Figure 28 : De gauche à droite, neurones dans le thalamus, le noyau caudé et le cortex. Les intensités de marquage de neurones (en marron) sont variables.
2. Les coupes de cerveau de macaque sont épaisses, dans notre cas 40 µm par coupe. Cette épaisseur est choisie car elle assure une résistance mécanique suffisante pour traiter ces larges coupes flottantes. De plus, cette valeur correspond à l’ordre de grandeur de la taille des plus grands neurones ce qui a été défini par les biologistes comme étant une valeur adaptée pour réaliser des comptages, notamment en stéréologie. Cependant, la production d’une image de projection de cette coupe lors de la numérisation entraîne un certain nombre d’effets négatifs qui peuvent aller d’un accolement de plusieurs cellules neuronales jusqu’à une superposition totale avec tout un ensemble de cas intermédiaires (Figure 29). Ces effets peuvent compromettre le comptage et l’analyse des neurones.
Figure 29 : Cellules superposées à gauche et cellules accolées à droite.
3. La taille des neurones est très variable et couvre un domaine allant de 5 à 30 µm de diamètre. Pour les individualiser, une méthode adaptée à la taille des neurones est requise. La Figure 30 montre des neurones juxtaposés de différentes tailles.
Figure 30 : Image montrant des neurones de différentes tailles accolés, le diamètre du petit neurone est à peu près de 7,078 µm, celui du grand neurone est d’environ 21,346 µm.
21.346 µm
33
4. Classiquement, la technique de la stéréologie qui nécessite de travailler en Z-stack au microscope est utilisée par les biologistes pour estimer de manière non biaisée le nombre de neurones dans la région anatomique étudiée. Pour cela, les biologistes se basent sur des stratégies de comptage manuel dans un nombre adapté de sous-régions échantillonnées pour permettre des estimations robustes (une description de cette méthode de référence sera présentée en détail dans la partie 2.1). Cependant, cette méthode d’analyse stéréologique manuelle est longue et très fastidieuse ce qui limite la quantité de tissus qui peut être étudiée par cette méthode. L’information obtenue est une estimation à l’échelle de la région et ne donne aucune indication locale sur le niveau d’hétérogénéité de la structure étudiée. De plus, certaines régions anatomiques sont composées d’amas de neurones très denses et de ce fait extrêmement difficiles à individualiser (ex. gyrus denté dans l’hippocampe dans la Figure 31). Dans ce cas précis, un comptage par les biologistes devient quasiment impossible à réaliser. Enfin, un traitement exhaustif de coupes entières voire de cerveaux entiers serait également quasiment impossible à réaliser car il faudrait traiter des téraoctets de données correspondant à des dizaines de millions de neurones et prendrait un temps considérable incompatible avec la durée des études précliniques.
Figure 31 : Neurones dans le gyrus denté de l’hippocampe de cerveau de macaque.
5. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous avons eu accès à un jeu de données de 134 coupes de cerveau d’un macaque, la taille d’une coupe numérisée de meilleure qualité (résolution 0,22 µm/pixel) pouvant atteindre jusqu’à 150 Go. Le temps de calcul, la possibilité d’accéder à ces données massives et la capacité de traitement d’une si grande image représentent de réels défis en terme de capacité matérielle (mémoire vive, réseau, stockage, puissance de calcul, etc.) mais également en terme de développement logiciel (accès aux données, algorithmes, etc.). 6. La plupart des études réalisées dans le domaine de l’individualisation des cellules se sont
concentrées sur des régions d’intérêt de petites dimensions ce qui limite fortement la complexité du problème et n’assure pas la généricité des solutions proposées si l’on vient à s’intéresser à des coupes entières ou à des cerveaux entiers. En effet, dans ces derniers cas, la quantité d’information à traiter explose littéralement et peut atteindre plusieurs centaines de gigaoctets jusqu’à quelques téraoctets de données. L’analyse de ces données massives devient rapidement problématique. De plus, réaliser un développement algorithmique sur des régions spécifiques limitées ne permet pas d’évaluer la capacité de la solution mise en œuvre à être déployée à très grande échelle ni à prendre en compte la diversité des configurations cellulaires qui peuvent être rencontrées dans des données très massives.
Compte tenu de l’ensemble des problèmes et des limitations que nous avons identifiés et qui sont décrits ci-dessus, les objectifs de mon projet de thèse sont les suivants :
Segmenter la classe de tissu correspondant aux neurones marqués par l’anticorps NeuN sur des coupes de cerveau de macaque de manière aussi précise et rapide que possible.
34
neurones qui se touchent.
Proposer une méthode automatique pouvant tenir compte de la taille variable des neurones. Compter les neurones dans les principales régions anatomiques du cerveau pour tester la
robustesse de la méthode proposée.
Calculer une série de descripteurs des neurones (colorimétriques, morphologiques, etc.).
Créer des cartographies paramétriques des descripteurs allant possiblement de l’échelle cellulaire à l’échelle mésoscopique afin de synthétiser le nombre, la morphologie et la distribution des neurones individualisés.
Créer des bases de validation utilisant des informations produites par des experts (méthodologistes, biologistes) pour valider les différentes étapes du protocole d’analyse des neurones développées à l’occasion de cette thèse.
Adapter notre environnement logiciel de travail, BrainVISA (http://brainvisa.info), afin de pourvoir traiter de très grands volumes de données (gestion des accès partiels à intégrer dans les codes).
Réduire les temps de calcul. L’optimisation et la parallélisation de l’algorithme est indispensable pour rendre possible l’analyse de cerveaux entiers qui se composent de dizaines voire de centaines de coupes histologiques de cerveau.
35