Utilisation de la NBO pour l'analyse de l'état fondamental et d’un état 3 MLCT du

Após a inalação de marijuana o THC é rapidamente absorvido nos pulmões, seguindo-se de uma rápida metabolização por enzimas do citocromo P450, maioritariamente CYP3A4, CYP2C9 e CYP2C11, a 11-hidroxi- Δ9-tetra-hidrocanabinol (11-OH-THC) e a 11-nor-9-carboxi- Δ9-tetra-hidrocanabinol (THC-COOH). O metabolito 11-OH-THC é um metabolito ainda com efeitos psicoativos, enquanto o THC-COOH é um metabolito inativo (Dasgupta 2010). Estes dois metabolitos são geralmente encontrados no plasma após inalação de marijuana (Vandrey et al. 2013).

1.4. Canabinoides Sintéticos 1.4.1. Aminoalquiloindois

Depois de perceber que o WIN 48,098 ((4-metoxifenil)-[2-metil1-(2-morfolin4- il-etil)indol-3-il]metanona) inibia a contração do estímulo eléctrico do ducto deferente em ratos e a síntese de prostangladinas, o grupo Sterling começou a sintetizar moléculas com uma estrutura semelhante à substância referida, com o objetivo de comercializar o principio ativo como contracetivo (Huffman 2009). Quatro dessas novas moléculas têm o grupo fenil substituído por um bicíclico aromático, e três desses derivados têm um grupo p-metoxibenzoil substituído pelo grupo 1-naftoil (Huffman 2009). Depois dessa síntese, observou-se que essas substâncias inibiam a enzima adenilato ciclase e interagia com a proteína G no cérebro (Huffman 2009). De todos os aminoalquindoles sintetizados o WIN 55,212-2 ((R)-(+)-[2,3-Di-hidro-5-metil-3-(4- morfolinilmetil)pirolo[1,2,3-de]-1,4-benzoxazin-6-yl]-1-naftalenilmetanona) foi o que mostrou mais potencial como contracetivo (Huffman 2009).

O grupo Sterling observou que o farmacóforo (região da molécula de um ligante que interage com o seu recetor) para esta classe de moléculas inclui dois elementos estruturais chave: (i) um grupo amina terciário na cadeia lateral ligados a um grupo índole e (ii) um grupo arilo (Huffman 2009).

Este grupo pode ser dividido em naftoindois, fenilacetilindois, naftilmetilindois e benzoindois.

JWH-018

O JWH-018 (figura 1.5) é um naftoindole. Este canabinoide sintético foi um dos primeiro a ser encontrado no produto “Spice”, uma mistura herbal que começou a ser comercializada na Europa como alternativa à marijuana, contendo ambas efeitos semelhantes (Atwood et al. 2010). Esta substância pode estar presente na constituição das misturas herbais em quantidades abaixo do limite de deteção até 35,90 mg/g (Uchiyama et al. 2010; Grabenauer et al. 2012).

Esta substância é um agonista dos recetores canabinoides, tendo uma maior afinidade para o CB1 (KI = 2,94±2,65 nM) do que para o CB2 (KI = 9±5 nM) (Showalter et al. 1996). Relativamente à dose efetiva, esta substância possui ED50 ~ 0,09 µmole/kg (Huffman 2009).

Figura 1.5 – Estrutura química do naftoindole JWH-018 (naftalen-1-il(1-pentilindol3-il)metanona) cuja fórmula química é C24H23NO.

JWH-073

O JWH-073 é um naftoindole semelhante ao JWH-018 definido apenas por um hidrocarboneto a menos na cauda alifática (figura 1.6). Esta substância começou a surgir em amostras herbais após a comercialização do JWH-018 se tornar ilegal (Lindigkeit et al. 2009). O JWH-073 encontra-se nas misturas herbais em quantidades que vão dos 5,428 mg/g a 11,38 mg/g (Grabenauer et al. 2012). Semelhante ao JWH- 018 esta substância é um agonista dos recetores canabinoides, tendo uma maior afinidade para o CB2 (KI = 8,9 ± 1,8 nM) do que para o CB1 (KI = 38 ± 24 nM) (Showalter et al. 1996). Relativamente à dose efetiva, possui ED50 ~ 1,3 µmole/kg (Huffman 2009).

Figura 1.6. – Estrutura química do naftoindole JWH-073 (1-butil3-(1-naftoíl)indol) cuja fórmula química é C23H21NO.

JWH-250

O JWH-250 é um fenilacetilindole constituído por um grupo índole com uma cauda de hidrocarbonetos (pentilo) e por um anel benzénico com um éter (figura1.7). Esta substância encontra-se nas misturas herbais em quantidades que vão dos 0,486 mg/g até aos 27,404 mg/g (Grabenauer et al. 2012).

Esta substância é agonista dos recetores canabinoides, tendo uma afinidade para o CB1 de 11 ± 2 nM e para o CB2 de 3,3 ± 2 nM (Huffman et al. 2005).

Figura 1.7 – Estrutura química do fenilacetilindole JWH-250 (1-pentil3-(2-metoxifenilacetil)indol) cuja fórmula química é C22H25NO2.

Efeitos fisiológicos e toxicidade

Hoyte e seus colaboradores descreveram como efeitos adversos dos canabinoides sintéticos, taquicardia, hipertensão e hipotensão, dor no peito, síncope, bradicardia, irritabilidade, sonolência, confusão, alucinações ou delírios, tontura e depressão respiratória. Havia ainda pacientes com convulsões, apesar de se verificar menos frequentemente, e dois dos pacientes desenvolveram estados de epilepsia (Hoyte et al. 2012). Mais tarde Gunderson et al. acrescenta como efeitos adversos problemas de raciocínio, dor de cabeça, boca seca, ansiedade, palpitações, sudorese, ataques de pânico, tosse e fadiga (Gunderson et al. 2013). A maioria dos efeitos adversos desaparece ao fim de 4 a 14 horas, apesar de um paciente num estudo de Hermanns- Clausen e seus colaboradores, que consumiu 6 dias seguidos estas misturas herbais, ter tido episódios de psicose durante vários dias. Neste estudo concluiu-se que os canabinoides sintéticos provocam efeitos adversos mais graves que os produtos da canábis, sendo este facto explicado pelos canabinoides possuírem uma maior afinidade

Relativamente ao conhecimento do desenvolvimento de tolerância a canabinoides sintéticos, Zimmermann e seus colaboradores publicaram um caso real de um individuo que desenvolveu tolerância a canabinoides sintéticos e que após um período de abstinência desenvolveu diversos sintomas como sudorese profusa, agitação, tremores palpitações, insónia, dor de cabeça, diarreia, náusea, vómitos, depressão, desespero e perda de peso (Zimmermann et al. 2009). A tolerância cruzada em que produtos com canabinoides sintéticos substituem a marijuana quando esta é retirada também já foi descrita em 2013 (Hopkins & Gilchrist 2013).

Os diversos efeitos psicoativos após o consumo destas substâncias são ainda partilhados em blogs na internet, existindo já produtos, como “Spice Diamond” e “Silent Black”, que os consumidores deste tipo de produtos classificam negativamente e não recomendam o seu consumo (Lindigkeit et al. 2009; Zimmermann et al. 2009).

Relativamente à toxicidade destas substâncias, foi estudada a citotoxicidade de canabinoides sintéticos, detetados na mistura herbal Spice, em linhas celulares de neuroblastoma que expressam recetores de canabinoides (NG 108-15), concretamente do CP 47,497 e do CP 47,497-C8 (5-(1,1-dimetil-octil)-2-[(1R,3S)-3-hidroxiciclo- hexil]-fenol) (Tomiyama & Funada 2011). Com este estudo foi possível concluir que estas substâncias apresentam citotoxicidade para estas células, sendo que a sua citotoxicidade é significativamente suprimida por um antagonista do recetor CB1, o AM251 (1-(2,4-diclorofenil)-5-(4-iodofenil)-4-metil-N-(1-piperidil)pirazole-3- carboxamide), mas não por um antagonista do recetor CB2, o AM630 (1-[2-(morfolin-4- il)etil]-2-metil-3-(4-metoxibenzoil)-6-iodoindole). Assim este estudo demostrou que o recetor CB1 tem um papel importante na indução da citotoxicidade destas moléculas nestas células. Neste estudo foi ainda demonstrado que estas substâncias induzem a apoptose destas células. Assim, estas moléculas demonstraram ser neurocitotóxicos, mostrando que o abuso destas substâncias pode causar défices cognitivos como a perda de memória e dificuldade a nível da atenção (Tomiyama & Funada 2014).

Recentemente estas substâncias foram também estudadas em mamíferos, onde comparando a potência de estímulos entre o Δ9 -THC e determinados canabinoides sintéticos em primatas Macaca mulatta, os canabinoides sintéticos demonstram ser mais potentes (Hruba & McMahon 2014; Rodriguez & McMahon 2014).

Metabolização

Muitos dos canabinoides sintéticos são metabolizados via oxidação (hidroxilação) em diversos locais, nos grupos substituintes do arilo ou naftilo, no anel índole e em cadeias laterais alquilo (Logan et al. 2011). Relativamente ao metabolitos de fase I, estes podem ser monohidroxilados, di-hidroxilados, e triplamente hidroxilado pelo citocromo P450 (Wintermeyer et al. 2010).

Grigoryev et al. realizou um estudo cujo objetivo foi identificar metabolitos do JWH-018 e JWH-073 por cromatografia gasosa acoplada a espectrómetro de massa (GC-MS), cromatografia liquida associada a um espectrómetro de massa (LC-MS) e cromatografia liquida associada a dois espectrómetros de massa (LC-MS/MS) a partir de 11 amostras de urina de humanos que consumiram estas substância e de 4 urinas de ratos. Estas substâncias foram extraídos das urinas por extração liquido-liquido e por extração de fase sólida. Para a análise por GC-MS as amostras foram derivatizadas. Este estudo teve como resultado a identificação de 14 metabolitos de JWH-018 e 1 do JWH- 073 nas urinas analisadas, e foi possível observar ainda que as vias metabólicas destas moléculas nos ratos e em humanos são diferentes. Relativamente aos metabolitos, este estudo sugeriu que a oxidação ocorre na cadeia alifática e não na parte aromática (Grigoryev et al. 2011).

Segundo um estudo realizado por Chimalakonda e seus colaboradores, foi caraterizada a glucuronidação do JWH-018 e JWH-073, e ainda outros produtos hidroxilados resultantes da metabolização destas substâncias através de microssomas hepáticos e intestinais, e UGT’s (Uridina-5'-difosfo-glucuronosiltransferase ) recombinantes humanos. O estudo mostra que a maioria das isoformas envolvidas na glucuronidação destas substâncias são predominantemente hepáticos (UGT1A1, UGT1A9 e UGT2B7) e extra-hepáticos (UGT1A10). Foi ainda possível verificar a expressão de isoformas de glucoronidases nos pulmões (UGT1A7) e cérebro (UGT1A3 e UGT2B7), sendo estes os órgãos que são diariamente expostos a estas substâncias em primeiro lugar (Chimalakonda et al. 2011).

Das análises realizadas para a deteção de metabolitos em consumidores de spice contendo JWH-018 e JWH-073, não foram encontradas as moléculas originais, somente os metabolitos. De qualquer forma, o consumo abusivo de canabinoides sintéticos pode

ser feita através da pesquisa dos seus metabolitos na urina por GC-MS e LC-MS/MS (Grigoryev et al. 2011) .

Mais tarde foram estudadas in vitro possíveis isoformas de P450 responsáveis pela oxidação do JWH-18 e AM2201 (1-[(5-fluoropentil)-1H-indol3-il]-(naftalen-1- il)metanona). As isoformas CYP1A2 e CYP2C9 foram as que demonstraram maior atividade na oxidação destas substância (Chimalakonda et al. 2012). O CYP1A2 foi o único que produziu derivados ω-COOH do JWH-018 na oxidação de JWH-018 e o CYP2C9 produziu níveis equivalentes de metabolitos ω-OH e ω-1-OH. O CYP2C19 catalisou predominantemente a formação de metabolitos ω-1-OH. O CYP2D6 catalisou a formação de diversos anéis índole juntamente com a formação de metabolitos com cadeia lateral alquilo hidroxilada.

CYP2C9 é uma das enzimas humanas mais polimórficas sendo expressa no fígado e intestinos, estando envolvida na metabolização de Δ9 – _{THC e de fármacos.} Assim a abundância desta isoforma nos intestinos sugere a metabolização de canabinoides sintéticos quando ingeridos oralmente (Chimalakonda et al. 2012). Relativamente ao CYP1A2, este contribui para o metabolismo hepático. Assim, indivíduos com baixa capacidade para expressar esta isoforma têm uma baixa capacidade para a destoxificação de canabinoides sintéticos, aumentando os riscos de efeitos adversos (Chimalakonda et al. 2012).

Chimalakonda e seus colaboradores sugerem que o CYP2D6 é uma isoforma do citocromo P450 importante na regulação das concentrações de canabinoides sintéticos no cérebro, pois é a isoforma que metaboliza o endocannabinoide anandamina, sendo sugerido que esta enzima oxida canabinoides sintéticos no cérebro (Chimalakonda et al. 2012).

A alta afinidade, potencia e eficácia do JWH-018 para os recetores canabinoides acoplada à sua metabolização em metabolitos ativos, explica que a exposição a estas substâncias gera efeitos agudos e crónicos mais intensos que os efeitos a um nível similar de exposição a Δ9 -THC (Brents et al. 2011).

Diferentes polimorfismos enzimáticos podem produzir diferentes níveis de metabolitos, o que varia de individuo para individuo, e ainda produzir preferencialmente um certo tipo de metabolitos (Brents et al. 2011). Dado que diferentes metabolitos exibem vários graus de atividade, uma predisposição para a

produção de metabolitos mais ativos pode aumentar a ativação dos recetores CB1. Pelo contrário, quando existe uma predisposição para a produção de metabolitos menos ativos por determinados indivíduos, consequentemente o individuo poderá aumentar a dose administrada numa tentativa de superar o efeito reduzido (Brents et al. 2011). Assim, de acordo com o perfil metabólico do individuo, efeitos complexos podem ter consequências únicas e potencialmente prejudiciais no balanço do sistema endocanabinoide, no qual este tem um papel fundamental na modulação do humor, apetite e homeostase energética, sensação de dor, função imunitária, fertilidade e possível homeostase óssea (Brents et al. 2011).

Relativamente à ação dos metabolitos, Brents et al. Demonstraram, pela primeira vez in vitro, que metabolitos hidroxilados desta substância se ligam com maior afinidade ao recetores CB1, ativando-os com maior eficácia quando comparada com o Δ9 – _{THC (Brents et al. 2011).}

Deteção de metabolitos em amostras biológicas

A deteção de substâncias em amostras post-mortem leva a preocupações diferentes, não só no procedimento de amostragem mas também no tratamento e armazenamento destas, na análise e ainda na interpretação forense (Castro et al. 2012). Há um aumento de suspeitas de consumo destes canabinoides por condutores, detetado pelas autoridades em operações stop, que apresentam sintomas do uso da canábis. No entanto como o resultado do teste de consumo de THC é negativo as autoridades não podem autuar os suspeitos (Lindigkeit et al. 2009; Gunderson 2013). Assim, a toxicologia forense está sujeita a pressões que obrigam a mudanças tanto em termos de procedimentos analíticos como na interpretação de resultados. O desenvolvimento de procedimentos e de metodologias para o screening das novas substâncias psicoativas ou para a confirmação e quantificação destas são cruciais para se perceber a influência das substâncias na causa da morte ou no paciente com alterações clinicas (Castro et al. 2012).

na cadeia alquilo. Como referido anteriormente, o JWH-018 não é eliminado a urina. Outros metabolitos presentes em menor quantidade são os carboxilados, os di- hidroxilados, os tri-hidroxilado reduzidos, os di-hidroxilado reduzidos e os monohidroxilado N-desalquilados. Existem ainda metabolitos glucuronizados (Sobolevsky et al. 2010).

Para a deteção de metabolitos, diferentes autores sugerem e otimizam diferentes técnicas para a sua deteção e identificação na urina. A extração das substâncias é realizada por extração em fase sólida e as técnicas de deteção presuntiva são realizadas por ensaios imunológicos, e confirmadas por cromatografia liquida associado a um espectrómetro de massa tipo TOF, LC-MS/MS, cromatografia liquida associado a um espectrómetro de massa triplo quadrupolo, cromatografia de ultra resolução acoplada a dois espectrómetros de massa (Kronstrand et al. 2014; Jang et al. 2013; Grigoryev et al. 2011; Wintermeyer et al. 2010; Barnes et al. 2014; Simões et al. 2014). Já foi também desenvolvido um teste imunoenzimático que permite a deteção preliminar dos canabinoides sintéticos mais consumidos na saliva (Rodrigues et al. 2013)