TRPP2 est flux‐dépendant 

Si  la  mécanodetection  du  flux  par  TRPV4  est  à  ce  jour  bien  démontrée  (Hartmannsgruber,  Heyken  et  al.  2007),  des  questions  se  posent  quant  à  la  capacité  de  TRPP2  à  sentir  ce  flux  au  niveau  des  cellules  endocardiques  du  poisson  zèbre.  Afin  de  répondre à cette question, j’ai injecté un double morpholino ; TRPP2‐Gata1 dans  les lignées  transgéniques Tg(klf2a_6kb : h2b‐eGFP) * Tg(fli‐NLS‐mCherry) roy+/‐. Le choix de l’injection  du morpholino TRPP2 avec le morpholino gata1 a été fait suite aux données générées par ce  dernier  sur  l’expression  du  gène  klf2a.  En  effet,  connu  pour  réduire  la  viscosité  sanguine  (Galloway, Wingert  et al.  2005),  ce  morpholino  a  également  montré une  augmentation  du  flux  reversant  au  niveau  du  canal  atrioventriculaire  (Vermot,  Forouhar  et  al.  2009)  ayant  pour  conséquence  une  surexpression  du  gène  klf2a  (Vermot,  Forouhar  et  al.  2009)    (cette  étude partie Résultats Chapitre 1) dans cette zone cardiaque. Cet excès de mécanodétection  par  les  morphants  gata1  co‐injectés  avec  le  morpholino  trpp2  permettra  donc  de  déceler  directement le rôle de TRPP2 vis‐à‐vis du shear stress. 

Les  poissons  injectés  avec  ce  double  morpholino  présentent  au  stade  48hpf,  un  œdème  cardiaque  ainsi  qu’un  cœur  mal  retourné.  Comme  lors  de  l’injection  de  trpp2Mo  seul, la courbure anormale de la queue est également présente et le nombre de battements  cardiaques légèrement diminué par rapport aux poissons contrôles (170bpm vs 188bpm). 

La mesure du fractional shortening à 48hpf pour les poissons injectés avec le double  morpholino  ne  montre  aucun  défaut  de  contraction  cardiaque  atriale  ni  ventriculaire.  Les  valeurs obtenues sont similaires à celles des contrôles mais aussi à celles mesurées pour le  morpholino gata1 injecté seul (Graphe 22; Annexe 1, vidéo n° 2, n°8 et 16). 

Chapitre 3    ‐ 173 ‐    Graphe 22: Efficacité de la contraction cardiaque à 48hpf chez les doubles morphants gata1‐TRPP2.  L’efficacité de la contraction de l’atrium et du ventricule n’est pas affectée par l’injection du double  morpholino, en comparaison aux poissons contrôles (CT) et aux poissons injectés avec gata1Mo  seul. CT n=10, gata1MO n=7, gata1‐trpp2Mo n=5.   

De  façon  forte  intéressante,  l’expression  du  gène  klf2a  après  double  injection  correspond à une baisse très prononcée au niveau de l’AVC des morphants (Figure 38), en  comparaison  aux  poissons  contrôles  (WT).  En  analysant  les  images  obtenues  pour  le  morpholino gata1 et celles obtenues pour la double injection, nous pouvons d’ores et déjà  mentionner une réponse au flux de la part de TRPP2 (Figure 38).  

Les comptages cellulaires effectués sur les poissons doublement injectés présentent  une baisse significative du nombre total de cellules dans l’endocarde, et ceci au niveau de  l’atrium (baisse de 75%), du ventricule (diminution de 30%) et de l’AVC (baisse de 66%) par  rapport  aux  poissons  contrôles.  Le  nombre  de  cellules  exprimant  le  promoteur 

klf2a_6kb :h2b‐eGFP est également fortement diminué au niveau de l’atrium (baisse de 79%) 

et de l’AVC (baisse de 48%) des poissons injectés avec trpp2‐gata1 par rapport aux poissons 

Chapitre 3   

significative du nombre total de cellules exprimant la m‐Cherry (+ 40% dans l’atrium, l’AVC et  le ventricule) ainsi qu’une forte progression du nombre de cellules exprimant klf2a (+ 59%  dans  l’atrium,  +45%  dans  l’AVC  et  +  43%  dans  le  ventricule)  par  rapport  aux  poissons  contrôles (Graphe 23).    Figure 39: Expression du promoteur klf2a_6kb :h2b‐eGFP et nombre total de cellules dans le cœur  des doubles morphants gata1‐TRPP2, à 48hpf. Projection maximale de cœurs à 48hpf. (A‐B, D‐E)  Présence de nombreuses cellules exprimant la gfp au niveau de l’AVC (triangle blanc) des poissons  contrôles (WT). (G‐H) Le nombre de cellules totales au niveau de l’AVC des poissons doublement  injectés est diminué. (C, F, I) Visualisation du nombre total de cellules exprimées dans l’endocarde. 

Chapitre 3    ‐ 175 ‐    Graphe 23: Comptage cellulaire après injection du double morpholino gata1‐TRPP2, à 48hpf.  Baisse significative du nombre total de cellules (mCherry) dans l’AVC, le ventricule et l’atrium et  diminution significative du nombre de cellules exprimant le promoteur_klf2a_6kb :h2b‐eGFP (GFP)  dans l’atrium et l’AVC des doubles morphants, par rapport aux CT. Augmentation significative des  cellules exprimant la gfp dans les deux chambres cardiaques et l’AVC des morphants gata1 ainsi  que du nombre de cellules exprimant le marqueur fluorescent mCherry dans l’atrium et l’AVC de  ces derniers. CT n=10, gata1MO n=7, gata1‐trpp2Mo n=5. *P<0,05 ; **P<0,001.     

La  comparaison  du  nombre  total  de  cellules  dans  l’endocarde  et  le  nombre  de  cellules  exprimant  klf2a  dans  les  poissons  injectés  uniquement  avec  gata1Mo  et  ceux  doublement injectés permet de montrer la forte dépendance au flux de TRPP2. 

Les  mesures  d’intensité  de  fluorescence  au  niveau  des  cellules  exprimant  le  transgène klf2a permettent elles aussi de montrer une baisse significative de la fluorescence 

gfp au niveau de l’atrium et de l’AVC des poissons injectés avec le double morpholino gata1‐

Chapitre 3      Graphe 24: L’intensité de fluorescence gfp relevée par le transgène klf2a nucléaire est diminuée  dans les morphants gata1‐TRPP2, à 48hpf. Observation d’une baisse significative de l’intensité gfp  dans les cellules de l’atrium (A) et de l’AVC des poissons doublements injectés, à 48hpf. CT n=10,  gata1MO n=7, gata1‐trpp2Mo n=5. *P<0,05 ; **P<0,001.      L’analyse de tous ces résultats permet de localiser TRPP2 comme étant en amont du  gène klf2a et lui confère un rôle majeur dans l’expression et le maintien de ce dernier. En  plus de jouer un rôle dans l’expression de klf2a et dans la valvulogénèse, j’ai pu démontrer la  dépendance de TRPP2 au shear stress au niveau des cellules de l’endocarde chez Danio rerio.   

Nous  avons  vu  précédemment  que  la  protéine  TRPP2  était  capable  de  se  lier  à  d’autres  TRPs.  Parmi  ces  dernières,  Köttgen  et  ses  collaborateurs  ont  mis  en  évidence  la  formation, après liaison de TRPP2 à TRPV4, d’un complexe polymodal et sensible de canaux  calciques  (Kottgen,  Buchholz  et  al.  2008).  Afin  de  voir  si  TRPP2  et  TRPV4  interagissent 

Chapitre 3   

‐ 177 ‐ 

ensemble  au  niveau  de  l’expression  de  klf2a,  j’ai  voulu  quantifier  cette  expression  en  absence de deux composés.