L’endocarde du poisson zèbre est cilié
2.2 Observation des cils dans l’endocarde
Suite à la validation des lignées transgéniques, j’ai voulu observer la présence de cils dans l’endocarde du poisson zèbre. J’ai ainsi utilisé la lignée Tg(UAS_arl13b‐RFP :cmlc2‐
eGFP) croisée avec la lignée Tg(flk1 :Gal4‐ UAS :eGFP) et effectué un traitement court de dix
minutes des poissons en 2,3BDM dans le but de stopper les contractions cardiaques (Cf. matériel et méthodes). L’imagerie des cœurs a été faite grâce au microscope confocal SP2. (cf. matériel et méthodes).
Lors de l’observation de cœurs embryonnaires de poissons WT à 30hpf, j’ai pu mettre en évidence la présence de nombreuses structures ciliées au niveau des cellules endocardiques du tube cardiaque. Ces cils primaires sont localisés tout le long du tube cardiaque et sont orientés vers le lumen (Figure 25 A; Annexe 1, vidéo n°11).
Suite à la découverte de cils dans l’endocarde à 30hpf et basée sur les découvertes menées par Slough et Van der Heiden, j’ai tout naturellement voulu voir si ces derniers étaient toujours visibles une fois le flux sanguin bien établi (correspondant à un shear stress augmenté au niveau des cellules de l’endocarde) et l’expression de klf2a déjà initiée dans l’AVC, c’est‐à‐dire à 48hpf. A ce moment du développement embryonnaire, la présence de cils primaires est bien visible au niveau de l’atrium et du ventricule ainsi qu’en bordure d’AVC. Comme à 30hpf, les cils sont orientés vers le lumen et possèdent un mouvement de type brownien engendré par l’arrêt des contractions cardiaques (Figure 25 B; Annexe 1, vidéo n°12 et n°13).
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Figure 25: Localisation des cils dans l’endocarde embryonnaire à 30hpf et 48hpf. Présence de cellules endocardiques ciliées (flèches blanches) à 30hpf (A) et 48hpf (B).
Afin de confirmer les données obtenues par microscopie confocale et avec l’aide de Yannick SCHWAB, j’ai confirmé leur présence via microscopie électronique à transmission (EMT). (cf. matériel et méthodes.)
Lors de l’observation d’une coupe cardiaque d’un poisson WT à 48hpf, nous avons pu mettre en évidence la présence de cils primaires orientés vers le lumen, dans l’atrium et le ventricule mais également en bordure d’AVC. La coupe présentée en figure 26 est une coupe cardiaque située au niveau des cellules endocardiques formant l’entrée du canal atrio‐ ventriculaire. La présence de microtubules le long du cil ainsi que du corpuscule basal sont visibles (Figure 26 B). Aucun cil n’a pu être observé dans le canal atrio‐ventriculaire, laissant penser, comme lors du développement cardiaque chez la souris, à une perte du cil lors de l’établissement du flux sanguin. Cependant nous avons pu en voir à l’entrée et à la sortie de l’AVC. On ne peut donc pas exclure l’implication des cils dans la valvulogénèse. Afin de confirmer ces dires, une inactivation de ces derniers serait nécessaire via l’inhibition, par
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exemple, des protéines de transport intra‐flagellaires ift88, ift57 ou encore ift172, intervenant dans la formation ciliaire (Lunt, Haynes et al. 2009).
Figure 26: Microscopie électronique à transmission de l’endocarde à 48hpf. (A) Présence d’un cil (carré rouge) au niveau d’une cellule endocardique en bordure d’AVC, échelle 2µm. (B) Zoom sur la
zone ciliée, échelle 0,25µm.
Les données générées précédemment sur le cœur de souris (Slough, Cooney et al. 2008) et chez le poulet (Van der Heiden, Groenendijk et al. 2006) démontrent toutes une perte ciliaire ou une réduction de leur taille dans les zones exposées à un shear stress élevé. Afin d’observer si la présence de flux et la notion de shear stress jouent un rôle dans la distribution des cils endocardiques chez le poisson zèbre, j’ai voulu observer la présence de ces derniers lors d’un excès, d’un défaut ou d’une absence totale de flux. Pour ce faire, j’ai
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respectivement injecté les morpholinos suivant ; gata1, cmlc1, cmlc2 et tnnt2 (cf matériel et méthodes).
Les lignées Tg(UAS_arl13b‐RFP :cmlc2‐eGFP) * Tg(flk1 :Gal4‐ UAS :eGFP) injectées avec le morpholino tnnt2, présentant une absence totale de contractions cardiaques et de flux, et avec le morpholino cmlc1, présentant un défaut important de contractions cardiaques ainsi qu’un flux fortement réduit (Cf. Chapitre 1), ont été traitées dix minutes en 2.3BDM et observées au microscope SP5 à 48hpf (Cf. matériel et méthodes). Dans ces morphants, la présence de cils a été retrouvée au niveau de l’endocarde de l’atrium, du ventricule de même qu’au niveau des cellules endocardiques de l’AVC (Figure 27 A‐B). Ces derniers sont orientés vers le lumen cardiaque et possèdent un mouvement brownien du fait de l’arrêt des contractions cardiaques par le traitement en 2.3BDM. Contrairement aux poissons WT, la présence de rares cils au niveau du canal atrioventriculaire en l’absence de flux permettrait d’associer le rôle majeur du shear stress à la répartition ciliaire endocardique chez le poisson zèbre.
Afin d’impacter, de façon moins dramatique que le morpholino cmlc1, les contractions cardiaques, j’ai utilisé le morpholino cmlc2, présentant une efficacité de contraction supérieure à celle des morphants cmlc1 (Cf. Chapitre 1), mais aussi un flux réduit par rapport aux poissons contrôles. De façon forte intéressante, la répartition ciliaire à 48hpf est majoritairement effectuée au niveau du ventricule (Figure 27 C) et aucun cil n’est retrouvé dans l’AVC. L’organisation des cils se révèle être anarchique, amenant même certains d’entre eux à être orientés vers le myocarde et non vers le lumen (Figure 27 D). Mis bout à bout, ces résultats suggèrent l’importance du flux et de la contraction cardiaque pour la formation du cil et l’orientation de ce dernier vers le lumen.
Chapitre 2 Figure 27: Les cils sont présents dans l’AVC des poissons présentant une absence ou une forte réduction du flux, à 48hpf. Présence de cil (en rouge) dans une cellule endocardique de l’AVC d’un poisson injecté avec tnnt2 (A) ou cmlc1 (B) à 48hpf. Localisation majoritaire des cils dans le ventricule des morphants cmlc2 (C) et orientation de ces derniers vers le myocarde (D, flèche blanche). Dans le but de confirmer l’implication du shear stress dans la répartition ciliaire, j’ai injecté le morpholino gata1 qui permet d’augmenter de façon générale ce shear stress au niveau des cellules endocardiques (Vermot, Forouhar et al. 2009). La présence des cils au niveau de l’atrium mais l’absence totale de structures ciliées au niveau de l’entrée et de la sortie de l’AVC, dans l’AVC et dans le ventricule corrèlerait, dans notre cas, avec le fait que
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plus le shear stress est élevé, moins nous retrouvons de cils dans l’endocarde (Iomini, Tejada et al. 2004; Van der Heiden, Groenendijk et al. 2006).
Ainsi, le shear stress et la contraction cardiaque joueraient un rôle prépondérant dans la formation et l’orientation ciliaire dans l’endocarde. Cependant, leur rôle dans cette couche cellulaire interne reste encore à définir.