3
Suite à l’observation de cils primaires dans l’endocarde du poisson, je me suis intéressée à leur répartition et éventuel rôle dans la détection fluidique. Pour ce faire j’ai manuellement compté le nombre de cellules exprimant la gfp au niveau de l’endocarde, ainsi que le nombre de cils exprimant le marqueur fluorescent RFP dans la totalité des cellules endocardiques à 30hpf et 48hpf. J’ai ensuite effectué un ratio cils/cellules pour chaque condition précédemment citées.
A 30hpf, les poissons contrôles présentent près de 67% de cellules endocardiques ciliées (données non montrées). Ce pourcentage baisse pour atteindre 30% à 48hpf, soit environ 15 cils pour 49 cellules (Graphe 15 A et B). La diminution du nombre de cellules ciliées à 48hpf peut, à ce niveau, être expliquée par la présence importante du shear stress au niveau des cellules endocardiques de l’AVC et du ventricule (Iomini, Tejada et al. 2004).
Chapitre 2
Graphe 15: Quantification ciliaire et nucléaire dans l’endocarde à 48hpf. Comptage du nombre total de cellules endocardiques (A) et de cils dans l’endocarde (B) dans des poissons WT et injectés
à 48hpf. n=4 pour toutes les conditions. *P<0,05 vs cellules WT ou cils WT ; **P<0,001 vs cellules WT ou cils WT.
Lors de l’injection des morpholinos gata1, peu de cils sont retrouvés au niveau des cellules endocardiques. En effet, seules 18% des cellules sont ciliées à 48hpf. La présence d’un flux augmenté dans certaines régions cardiaques des morphants gata1 pourrait, encore une fois, expliquer la perte de plus de la moitié des cils par rapport aux poissons contrôles dans l’endothélium cardiaque (Graphe 15B), notamment dans les zones soumises à un fort shear stress (AVC, V).
Les poissons injectés avec le morpholino tnnt2 présentent un nombre de cellules dans l’endocarde et un nombre de cils significativement diminués en comparaison aux poissons contrôles (Graphe 15A et B), mais présentent, de façon intéressante, une répartition ciliaire identique à celle des morphants gata1 (18%). L’utilisation du morpholino
cmlc1, permet quant à elle de distinguer environ 32% de cellules ciliées tout au long de
l’endocarde, à 48hpf, soit une proportion ciliaire similaire à celle des poissons contrôles. Ces données permettent d’impliquer le flux, même minime, à la formation ciliaire dans l’endocarde.
Chapitre 2
‐ 137 ‐
Les poissons injectés avec cmlc2Mo, présentent quant à eux, et de façon assez surprenante, plus de 40% de cellules ciliées dans l’endocarde. En considérant que le nombre de cellules dans l’endocarde est réduit par rapport à celui des poissons contrôles (Graphe 15 A), la proportion ciliaire est légèrement plus importante dans les morphants que dans les poissons WT. Ces données suggèrent la mise en évidence l’implication du flux dans la répartition ciliaire mais également dans le maintien de ces derniers au cours du développement embryonnaire.
Malgré les données intéressantes générées lors de l’analyse de la répartition ciliaire, nous ne pouvons pas ne pas relever le faible pourcentage de cils retrouvé dans l’endocarde à 48hpf. En effet, les poissons contrôles ne présentent pas plus de 32% de cellules endocardiques ciliées soit une moyenne de 15 cils pour 49 cellules endocardiques (Graphe 15 A‐B). Hormis pour le morpholino cmlc2, ce faible pourcentage est retrouvé dans les autres conditions testées, indépendamment de la présence de flux ou de contractions. La faible proportion ciliaire pourrait amener à penser à un rôle mineur des cils lors de la mécanodétection fluidique à 48hpf au profit d’autres mécanosenseurs endocardiques.
Conclusion
4
La détection fluidique à la surface des cellules endocardiques est une des étapes majeure à la propagation du signal intracellulaire (Sharefkin, Diamond et al. 1991). Malgré de nombreux senseurs de flux décrits au niveau des cellules endothéliales, le cil reste un des candidats prédominant à cette détection (Sharefkin, Diamond et al.). Dans cette présente étude, après validation de nouvelles lignées transgéniques spécifique du cil primaire
Chapitre 2
(arl13b), j’ai mis en évidence la présence de cils dans les cellules de l’endocarde de poisson zèbre à 30hpf et 48hpf. Jamais observés dans l’endocarde, cette découverte a tout d’abord permit d’entrevoir, comme décrit chez les mammifères, le cil comme étant un bon modèle de senseur de flux au niveau des cellules endocardiques. De plus, la présence chez les poissons WT et chez les morphants gata1 de cils dans des zones présentant un faible shear stress (atrium) et leur absence dans les zones où ce dernier est élevé (AVC, V), a permis de mettre en évidence un lien direct entre le shear stress et la répartition ciliaire. Cependant, cette notion reste à élucider dans les poissons injectés avec les morpholinos tnnt2 et cmlc1. En effet, l’absence totale de flux dans les morphants tnnt2 ou la très forte réduction de ce dernier dans les morphants cmlc1, permet tout de même la détection de cils dans l’endocarde. Bien que significativement diminués en l’absence totale de flux, le nombre de cils présents dans les poissons injectés avec cmlc1 se révèle être similaire à ceux des contrôles. Ce taux identique indiquerait que la présence d’un flux, aussi infime qu’il soit, permettrait la formation de cils dans l’endocarde. Ces données semblent être confirmées par le morpholino cmlc2, présentant un flux plus important que dans les poissons injectés avec cmlc1. Il serait alors intéressant de quantifier ce flux afin de déterminer la quantité minimale nécessaire à la ciliogénèse.
Malgré la découverte forte encourageante de cellules endocardiques ciliées, leur faible répartition dans l’endocarde (moins de 30% de cellules ciliées) ne permet pas l’implication d’un rôle majeur des cils lors du développement cardiaque chez l’espèce Danio rerio.
Chapitre 2 ‐ 139 ‐ Cette faible proportion laisse présager l’intervention d’un autre mécanodétecteur au niveau des cellules endothéliales, tels les canaux membranaires. Parmi ces derniers, un est tout de même étroitement lié au cil dans l’endocarde ; le complexe TRPV4‐TRPP2.