Mécanodétection endocardique:
Figure 36 : Phénotype, à 48hpf, d’un poisson injecté avec le morpholino trpp2 (A) Poisson
4.6 TRPP2 et TRPV4 affectent l’expression de klf2a
Afin d’observer une éventuelle interaction entre TRPV4 et TRPP2 au niveau de l’expression génique de klf2a, j’ai croisé les lignées transgéniques Tg(klf2a_6kb : h2b‐eGFP) *
Tg(fli‐NLS‐mCherry) roy+/‐ que j’ai injecté avec le double morpholino TRPP2‐TRPV4.
L’observation à 48hpf au microscope confocal SP2, permet de détecter les cellules totales formant l’endocarde en rouge ainsi que les cellules exprimant le transgène klf2a en vert.
Les poissons injectés présentent un petit œdème cardiaque ainsi qu’un cœur mal retourné. Une hydrocéphalie ainsi que le phénotype en « tire‐bouchon » de la queue du poisson sont également visibles. La circulation sanguine est effective malgré la diminution du nombre de battements par minute (145 bpm vs 180bpm chez les WT).
Le fractional shortening calculé se révèle être similaire aux mesures effectuées chez les poissons contrôles. Aucun défaut de contraction n’est relevé autant au niveau de l’atrium que du ventricule (Graphe 25; Annexe 1, vidéo n° 2 et n°17).
Chapitre 3 Graphe 25: Efficacité de contraction cardiaque du double morphant TRPP2‐TRPV4, à 48hpf. L’efficacité de contraction de l’atrium et du ventricule n’est pas affectée par l’injection du double morpholino, en comparaison aux poissons contrôles (CT). CT n=10, trpv4‐trpp2Mo n=5.
L’observation des images générées avec le microscope confocal SP2 (Figure 40) ainsi que le comptage cellulaire (Graphe 26) révèlent, en comparaison avec les contrôles, un baisse significative de près de 60% du nombre total de cellules dans l’endocarde ainsi que du nombre de cellules exprimant la gfp dans l’AVC des poissons doublement injectés. Outre l’impact du double morpholino sur les cellules de l’AVC, nous pouvons aussi apercevoir une diminution du nombre de cellules exprimant la gfp au niveau du ventricule. Aucun changement clair n’est visible au niveau de l’atrium. En comparant ces résultats avec ceux obtenus pour TRPP2Mo et TRPV4Mo, nous pouvons observer une baisse plus importante de la mCherry et de l’expression du promoteur klf2a_6kb :h2b‐eGFP au niveau de l’AVC seulement. Ces données indiquent un rôle essentiel du complexe TRPP2‐TRPV4 pour l’expression du gène klf2a au niveau des zones présentant un shear stress élevé (AVC).
Chapitre 3 ‐ 179 ‐ Figure 40: Expression du transgène klf2a et du nombre total de cellules dans le cœur des morphants TRPP2‐TRPV4, à 48hpf. Projection maximale de cœurs à 48hpf. Présence de nombreuses cellules exprimant la gfp au niveau de l’AVC (triangle blanc) des poissons contrôles (WT). Le nombre de cellules exprimant le transgène klf2a au niveau de l’AVC des morphants est diminué (D‐E), ce qui n’est pas le cas du nombre total de cellules dans l’endocarde (mCherry) (C et F).
Chapitre 3 Graphe 26: Comptage cellulaire après injection du double morpholino TRPP2‐TRPV4, à 48hpf. Baisse significative du nombre total de cellules (mCherry) dans l’AVC et diminution du nombre de cellules exprimant le transgène klf2a (GFP) dans l’AVC et le ventricule des morphants. CT n=10, trpv4‐trpp2Mo n=5. *P<0,05 ; **P<0,001.
La mesure de l’intensité cellulaire confirme une diminution significative de l’expression du transgène klf2a au niveau de l’atrium, du ventricule ainsi que de l’AVC chez les poissons injectés avec le double morpholino et en comparaison avec les poissons contrôles. Respectivement, nous observons une baisse de 65%, 44% et 54% dans l’atrium, l’AVC et le ventricule (Graphe 27).
Chapitre 3 ‐ 181 ‐ Graphe 27: L’intensité de fluorescence relevée par le transgène klf2a nucléaire est diminuée dans les morphants TRPP2‐TRPV4, à 48hpf. Observation d’une baisse significative de l’intensité gfp dans les cellules de l’atrium (A), de l’AVC et du ventricule des poissons doublements injectés, par rapport aux poissons contrôles à 48hpf. CT n=10, trpv4‐trpp2Mo n=5. *P<0,05 ; **P<0,001.
Conclusion
5
Dans cette partie, j’ai pu mettre en évidence la localisation à la surface cellulaire de TRPV4 ainsi que la localisation cytoplasmique de TRPP2. Afin de confirmer une expression spécifique de TRPP2 dans le réticulum endoplasmique, il faudrait pouvoir faire des images bien plus précises que celles obtenues par microscope confocal SP5. Lors de la visualisation de l’emplacement de ces deux protéines dans l’endocarde, je n’ai pu mettre en évidence une colocalisation ciliaire. En effet, le nombre de cellules ciliées étant faible à 48hpf, il est possible que la colocalisation se retrouve elle aussi réduite. Suite aux travaux de Teilmann et ses collaborateurs (Teilmann, Byskov et al. 2005), nous pouvons aussi penser que laChapitre 3
présence de cils dans l’endocarde ne soit pas de type « moteur » et ne colocalisent donc pas avec les protéines TRPs. Cependant, il serait bon d’observer une éventuelle colocalisation en utilisant des lignées transgéniques surexprimant TRPV4 et TRPP2 dans l’endocarde. Cette surexpression permettrait de mieux caractériser la présence de ces protéines dans les cellules endocardiques. Les lignées permettant cette manipulation sont actuellement en cours de génotypage au laboratoire.
Lors de l’observation de l’expression du gène klf2a dans le cœur, nous observons une baisse significative du nombre total de cellules de l’endocarde et des cellules exprimant la
gfp, au niveau de l’AVC, quel que soit le morpholino utilisé (TRPV4Mo, TRPP2Mo, TRPP2‐ TRPV4Mo). Cette diminution permet en premier lieu de situer TRPP2 et TRPV4 comme étant
en amont du gène klf2a, mais aussi de mentionner leur importance dans l’expression et le maintien de ce dernier au niveau des zones subissant un fort shear stress comme l’AVC. En l’absence de PKD2 nous avons aussi enregistré une diminution significative de l’intensité de fluorescence du transgène klf2a au niveau des cellules de l’AVC des morphants. Notons également la présence de quelques variations pouvant être observées au niveau du nombre cellulaire total dans l’endocarde et exprimant le transgène klf2a au niveau de l’atrium et du ventricule, indépendamment de l’efficacité de contraction atriale et ventriculaire des poissons injectés.
La relation entre TRPV4 et le shear stress, bien décrite de nos jours (Kohler, Heyken et al. 2006; Hartmannsgruber, Heyken et al. 2007; Wu, Gao et al. 2007; Berrout, Jin et al. 2012), nous a permis d’émettre l’hypothèse de la dépendance au flux de TRPP2 au niveau de l’endocarde de Danio rerio. L’utilisation du morpholino gata1 présentant un flux reversant fortement augmenté au niveau de l’AVC nous a servi de contrôle interne dans la
Chapitre 3
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manipulation permettant alors de mettre en évidence la dépendance au flux de TRPP2. En effet, et en comparaison avec les poissons WT et ceux injectés avec gata1Mo seul, l’injection du double morpholino gata1‐TRPP2 présente une baisse conséquente du nombre total de cellules dans l’endocarde et du nombre de cellules exprimant le promoteur klf2a_6kb :h2b‐
eGFP au niveau des deux chambres cardiaques et de l’AVC. Nous avons aussi remarqué une
perte de l’intensité de fluorescence du transgène klf2a dans ces régions cardiaques, par rapport aux poissons contrôles. Ces données permettent de conclure à la dépendance au flux de TRPP2 dans l’endocarde du poisson zèbre, notamment dans les régions soumises à un fort shear stress (AVC).
Outre la dépendance au flux, les expériences permettant de visualiser la présence de bourrelets endocardiques au niveau de l’AVC, nous ont permis via la présence d’amas cellulaire fortement marqués par le marqueur de différenciation cellulaire Zn‐8, de révéler l’implication directe ou indirecte, de TRPV4 et TRPP2 dans la valvulogénèse. Sachant que TRPV4 et TRPP2 correspondent à des canaux membranaires permettant le passage d’ions calciques dans la cellule. Le calcium pourrait être un élément indispensable au bon fonctionnement cellulaire et à la détection du shear stress. Dans le but d’approfondir les résultats obtenus avec TRPP2 et TRPV4, je me suis donc tout naturellement orientée, dans un premier temps, vers le signal calcique intracellulaire pouvant être retrouvé dans les cellules endocardiques du poisson zèbre, puis vers les différentes voies moléculaires induites par le calcium.