Zhong, S., Zhang, C. and Johnson, D.L. (2004) Epidermal growth factor enhances cellular
TATA binding protein levels and induces RNA polymerase I- and III-dependent gene
activity. Mol Cell Biol, 24, 5119-5129.
Annexes:
Etude de la fidélité de l’ARN polymérase la Pol III
Parallèlement à l’étude mécanistique de la transcription Pol I, j’ai participé durant ma thèse au projet d’un chercheur post-doctoral, N. Alic, qui s’intéressait aux mécanismes de la fidélité transcriptionelle de la Pol III. Comme mentionné dans l’introduction, cette ARN polymérase synthétise des petits ARN stables et non traduits, dont les ARN de transfert (ARNt) ou l’ARNr 5S. En plus de la Pol III, les facteurs de transcription TFIIIB et TFIIIC sont indispensables pour transcrire spécifiquement les gènes d’ARNt (Kassavetis and Geiduschek, 2006).
La transcription des gènes d’ARNt a été reconstituée in vitro chez la levure à partir des complexes TFIIIB et TFIIIC recombinants et d’ARN Pol III purifiée (Ducrot et al., 2006)
Les ARN polymérases ne sont pas aussi fidèles que les ADN polymérases. Les erreurs lors de la transcription sont toutefois moins délétères que celles qui ont lieu lors de la réplication du fait de la transmission de l’ADN à la descendance. La fréquence d’incorporation d’un nucléotide incorrect lors de la transcription est estimée à 10-3 et
10-5 pour l’ARN polymérase bactérienne (Erie et al., 1992), alors qu’elle n’est que de 10-6
à 10-9 lors de la réplication. Les mécanismes par lesquels les ADN polymérases assurent
la fidélité de la réplication sont bien caractérisés : ces enzymes sont hautement sélectives lors du choix du nucléotide correct, l’utilisant 103 à 106 fois plus efficacement
qu’un nucléotide incorrect. De plus, l’activité exonucléase 3’-5’ des ADN polymérases leur permet de corriger les erreurs commises lors de la réplication.
Les études relatives à la fidélité des ARN polymérases sont moins nombreuses. Chez les eucaryotes, seule la fidélité de la Pol II a été étudiée en détail: cette étude a permis de déterminer in vitro la sélectivité de l’enzyme pour le nucléotide correct et de mettre en avant le rôle clé du facteur de clivage TFIIS dans la fidélité de la Pol II (Thomas et al., 1998). L’activité de clivage des ARN au sein des complexes ternaires d’élongation est conservée dans les 3 règnes du vivant (procaryotes, archées, eucaryotes). Bien que catalysée par le site actif des ARN polymérases, Cette activité n’est pas la réaction
qui ne peut s’exprimer qu’au sein des complexes ternaires et qui nécessite dans la plupart des cas un facteur exogène (facteur de clivage, TFIIS dans le cas de la Pol II). En résumé, cette activité est importante pour cliver un transcrit dont l’extrémité 3’ est désengagée du site actif lors d’un arrêt accidentel du complexe d’élongation. Le clivage de l’ARN génère une nouvelle extrémité 3’ correctement positionnée dans le site actif. Sans cette réaction, les complexes ternaires bloqués sont incompétents pour reprendre la transcription.
Le rôle potentiel de l’activité de clivage des ARN polymérases dans la fidélité de la transcription est évidemment à rapprocher de la fonction de l’activité exonucléasique des ADN polymérases dans la fidélité de la réplication.
Contrairement à ce qui est observé pour la plupart des ARN polymérases, l’activité de clivage de la Pol III est intrinsèque à l’enzyme et implique la sous-unité C11 (Chédin et al., 1998). Le rôle de cette petite sous-unité essentielle est en fait complexe. Il a été montré au laboratoire qu’outre son implication dans le clivage de l’ARN au sein des complexes ternaires, la sous-unité C11 était requise pour la réinitiation facilitée de la Pol III et ce de façon clivage-indépendante (Landrieux et al., 2006).
A) Etude de la fidélité de l’ARN polymérase III
Le projet de Nazif Alic visait à caractériser les mécanismes moléculaires contrôlant la fidélité de la transcription Pol III. Pour ce faire, il a comparé l’incorporation d’un nucléotide mésapparié par la Pol III Wt et par la Pol III∆ (une forme incomplète d’enzyme dépourvue des sous-unités C11, C37 et C53 ne possédant plus d’activité intrinsèque de clivage et qui peut être obtenue par purification de la Pol III à partir de mutants). Le système de transcription spécifique in vitro utilisé au laboratoire comprend les facteurs TFIIIB et TFIIIC recombinants, et la Pol III purifiée. La matrice utilisée dans ces tests est le gène codant l’ARNtSup4. En résumé, ce gène est préincubé pendant 20 minutes à 25°C en présence des facteurs TFIIIB et TFIIIC, et une quantité limitante de Pol III est ajoutée pendant 20 minutes pour former le complexe
de préinitiation. Enfin, l’addition des nucléotides permet le démarrage de la transcription.
Il est important de noter que la séquence codante Wt de la matrice Sup4 ne comporte pas de G dans les 17 premiers nucléotides. Ainsi, quand la transcription est réalisée en l’absence de GTP, les complexes ternaires dans lesquels ADN, ARN néosynthétisés et Pol III sont associés de façon stable sont arrêtés en position +17 mais restent compétents pour la reprise de l’élongation si le GTP est ajouté au milieu réactionnel. En l’absence de GTP, la Pol III∆ incorpore un nucléotide mésapparié en position +18 (préférentiellement un A à la place d’un G) qu’elle est évidemment incapable de cliver.
Pour les expériences de clivage, les complexes ternaires bloqués à +17 sont purifiés par chromatographie de perméation sur gel, puis sont incubés en l’absence de nucléotides dans un tampon contenant du MgCl2 à 8mM.
Grâce à des expériences de reconstitution in vitro de la Pol III∆ avec des sous unités C37, C53, C11 Wt ou mutante (incapable de restaurer l’activité de clivage), nous avons pu déterminer les constantes de vitesse apparentes d’incorporation de nucléotides corrects ou incorrects après un nucléotide mésapparié ou correctement apparié. Les vitesses de clivage de ces nucléotides ont également été déterminées.
L’ensemble de ces données a fait l’objet d’une publication jointe en annexe 2. En résumé, nous avons démontré que la Pol III incorporait un nucléotide correct environ mille fois plus efficacement qu’un nucléotide incorrect, et que le clivage d’un nucléotide mésapparié était 8 fois plus rapide que le clivage d’un nucléotide apparié. Contrairement à ce qui est observé pour la Pol II, l’addition par la Pol III d’un nucléotide correct après un mésappariement constitue l’étape cinétiquement la plus lente lors de la synthèse de transcrits contenant une seule erreur. Enfin, grâce à des modélisations in silico, nous avons pu établir qu’in vitro, l’activité de sélectivité des nucléotides et l’activité de clivage de l’ARN contribuaient de façon équivalente à la fidélité de la transcription Pol III.