2-3) Immunoprécipitation de la chromatine

Pontage covalent in vivo :

Les cellules sont récoltées en phase exponentielle de croissance (DO=1), puis le pontage est effectué par l’addition de formaldéhyde à la concentration finale de 1%. Après une incubation à température ambiante pendant 20 minutes, le pontage est arrêté par ajout de glycine à une concentration finale de 125 mM. Les cellules sont soumises à une agitation à température ambiante pendant 5 minutes, puis récoltées par centrifugation. Les culots cellulaires sont lavés dans 50ml de Tris 20mM pH 8 froid puis sont centrifugés 3 minutes à 4000 rpm. Les culots sont ensuite congelés à -80°C.

Préparation de la chromatine :

Après décongélation, les cellules sont reprises dans 5ml de tampon de lyse FA/SDS/PMSF (50 mM Hepes-KOH pH 7,5 ; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X- 100, 0,1% Déoxycholate de sodium, 0,1% SDS, PMSF ajouté extemporanément à une concentration finale de 1 mM) puis centrifugées 3 minutes à 4000 rpm. Les culots sont resuspendus dans 1 ml de tampon de lyse, puis transvasés par 500µl dans deux tubes eppendorf de 2ml. 500µl de billes de verre (425-600µm) sont ensuite ajoutés et les cellules sont broyées au vibrax à puissance maximale à 4°C. Pendant le broyage, des tubes Greiner de 12ml sont percés avec une aiguille (0,7X30nm ou 0,5X15nm). Les tubes sont ensuite placés dans des tubes Falcon de 50ml froids.

Une fois le broyage terminé, les échantillons sont transvasés dans les tubes Greiner percés. Les tubes contenant le broyat sont lavés avec 1ml de tampon de lyse FA/SDS/PMSF froid. Les broyats sont isolés des billes par centrifugation 1 minute à 2000 rpm. Les éluats sont ensuite transférés dans des tubes corex 15ml stériles, puis sont centrifugés à 12000rpm à 4°C pendant 20 minutes. Chaque culot est dissous dans 1,6ml de tampon de lyse et transvasé dans un tube eppendorf de 2ml. Ce dernier est ensuite mis sur roue rotative à 4°C pendant une heure. Une centrifugation à 15000rpm est ensuite réalisée pour récolter la chromatine. Les surnageants sont aspirés et les culots sont remis en suspension dans 1,6 ml de tampon de lyse FA/SDS/PMSF. Une incubation des échantillons sur roue rotative à 4°C est réalisée pendant 20 minutes.

Sonication de la chromatine :

Les tubes sont placés dans un mélange eau/glace. La sonde du sonicateur est placée à 3- 4mm du fond des tubes. Chaque échantillon est soniqué trois fois pendant 40 secondes à puissance 4, 60% duty cycle, et mode pulsed (Sonicateur CellTM_{, Sonics and materials}

INC, Danbury, Connecticut, USA), avec 20 secondes d’intervalle entre deux sonications, pour générer des fragments d’ADN d’une longueur moyenne de 500 pb. Le mélange est ensuite transféré dans un tube Greiner de 12 ml. 3ml de tampon de lyse sont ajoutés à chaque échantillon et les tubes sont ensuite placés sur roue rotative à 4°C pendant 30 minutes. Une centrifugation à 10000 rpm pendant 30 minutes est ensuite réalisée pour rendre soluble la chromatine. La chromatine est aliquotée par 700 µl et congelée à - 80°C.

Qualité de la sonication :

Une digestion des protéines par la pronase (12,5 µl de pronase à 20 mg/ml) de 350µl de chromatine est réalisée 1h à 37°C . La réversion du pontage ADN/protéines est obtenue en incubant les échantillons toute la nuit à 65°C. Les extraits sont ensuite incubés 1h à 37°C en présence de RNase A (0,8 µl à 10 mg/ml) afin d’éliminer les ARN. Les fragments d’ADN sont ensuite purifiés avec le kit PCR purification de Quiagen. L’élution se fait dans 100µl de Tris 10 mM pH8. La taille des fragments d’ADN obtenus après sonication est analysée sur une aliquote de 20 µl par électrophorèse sur gel d’agarose 0,8% TBE.

Immunoprécipitation :

50µl de billes couplées à des anticorps dirigés contre des anticorps de souris ou de lapin sont lavées 3 fois avec 500µl de PBS/BSA 0,1%, puis sont repris dans 100 µl de la même solution. L’anticorps dirigé contre la protéine d’intérêt est alors ajouté afin d’être couplé à l’anticorps déjà présent sur les billes. Ce couplage se fait pendant 30 minutes à 30°C sous une agitation de 1300 rpm. Suite à cette incubation, trois lavages dans 500 µl de PBS/BSA 0,1% sont réalisés. Le dernier lavage se fait 10 minutes à 30°C sous agitation à 1300 rpm. 500µl de chromatine et 50µl de PBS/BSA (10 mg/ml) sont ensuite ajoutés aux billes, puis les mélanges sont incubés à 21°C pendant 2 heures sous agitation

à 1300 rpm. Les billes sont ensuite reprises dans 500 µl de tampon de lyse et transférées dans un tube propre. Trois lavages sont effectués avec 1ml de tampon de lyse dont la concentration en NaCl est ajustée à 500mM. Le dernier lavage se fait à 21°C pendant 20 minutes sous agitation à 1300 rpm. Les échantillons sont ensuite lavés dans 500µl de tampon IP (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1mM EDTA, 0,5% NP40, 0,5% déoxycholate de sodium) puis dans 500µl de TE. Les billes sont ensuite remises en suspension dans 125µl de tampon Pronase dilué 5 fois (25mM Tris pH7,5 ; 5mM EDTA, 0,5%SDS) pour l’élution des protéines à 65°C pendant 20 minutes. Afin d’hydrolyser les protéines, 6,25ul de pronase (20mg/ml) et 25µl de tampon pronase (125mM Tris pH7,5 ; 25mM EDTA, 2,5%SDS) sont également ajoutés à 100µl d’extrait brut (Input).

Réversion du pontage ADN- protéines :

Après 1 heure à 37°C, la réversion du pontage ADN-protéines est obtenue en incubant toute la nuit à 65°C. Les extraits sont ensuite incubés 1 heure à 37°C en présence de 0,8µl de RNaseA (10 mg/ml) afin d’éliminer les ARN. Les fragments d’ADN sont ensuite purifiés avec le KIT PCR purification de Quiagen. L’élution se fait avec 100 µl de Tris 10 mM pH 8. Une seconde élution est ensuite réalisée avec 100 µl de Tris.

PCR en temps réel :

Les fragments d’ADN co-immunoprécipités sont détectés par PCR quantitative en temps réel. Les réactions sont effectuées dans des plaques 96 puits (thermo-Fast 96 Reaction, Abgene) en utilisant SYBR Green Master Mix (Invitrogen) et le programme 35 X 15 secondes à 95°C, 1 minute à 60°C sur un appareil ABI PRISM 7000 (Applied Biosystems). Chaque PCR est réalisée en duplicata dans un volume final de 25 µl à partir de 5 µl d’ADN purifié (IP ou Input) et 10 pmoles de chaque amorce. Une courbe de dissociation des amplicons est déterminée par augmentation progressive de la température en fin de réaction afin de vérifier la spécificité de chaque amplicon. Afin de calculer l’enrichissement de la protéine d’intérêt, une valeur seuil Tc (threshold cycle) est d’abord déterminée pour chaque PCR. Cette valeur correspond au cycle au cours duquel le signal de fluorescence émanant d’un puits atteint un niveau 10 fois supérieur au signal moyen du bruit de fond mesuré pour l’ensemble des puits.

En se référant à une courbe standard réalisée sur des dilutions en série d’ADN, une quantité relative d’ADN est attribuée à chaque cycle. L’enrichissement d’une protéine correspond donc au pourcentage de la quantité d’ADN co-immunoprécipité (IP) par rapport à la quantité d’extrait brut (Input).

II-2-4) Immunofluorescence

Les cellules provenant de 9 ml de culture sont fixées par ajout de 1 ml de formaldéhyde 37% (Sigma) directement dans le milieu de culture et agitation douce. Les cellules sont ensuite centrifugées à 4000 rpm, 4 minutes et le culot est lavé deux fois avec 1 ml de tampon KP sorbitol (50 mM KPO4 pH 6,5 ; 0,5 mM MgCl2, 1,2 M sorbitol) 4°C et est

repris dans 1ml de tampon KP sorbitol.

La paroi des cellules (150 µl) est digérée avec 15µl de β-mercaptoéthanol et 10 µl de zymolyase 100T (100 mg/ml) pendant 20 minutes à 37°C. Les cellules sont lavées une fois avec 0,5 ml de PBS 1X , 1% fish gélatine (Sigma), deux fois avec 0,5ml de PBS 1X , 1% fish gélatine, 0,1% Triton X-100 , une fois avec 0,5ml de PBS 1X , 1% fish gélatine et reprises enfin dans 50µl de PBS 1X , 1% fish gélatine. L’anticorps primaire dilué 1/100 est ajouté et les cellules sont incubées 1 heure à température ambiante.

Les cellules sont lavées une fois avec 0,5 ml de PBS 1X , 1% fish gélatine, deux fois avec 0,5ml de PBS 1X , 1% fish gélatine, 0,1% Triton X-100 , une fois avec 0,5ml de PBS 1X , 1% fish gélatine et reprises enfin dans 50µl de PBS 1X , 1% fish gélatine. L’anticorps secondaire (IgG alexa 594 , ou goat anti mouse FITC dilués 1/100 ) est ajouté et les cellules sont incubées 1 heure à température ambiante.

Les cellules sont lavées une fois avec 0,5 ml de PBS 1X , 1% fish gélatine, deux fois avec 0,5ml de PBS 1X , 1% fish gélatine, 0,1% Triton X-100, et reprises dans 0,5ml de PBS 1X , 1% fish gélatine, 5µl de DAPI à 50µg/ml. Après incubation pendant deux minutes à température ambiante, les cellules sont lavées par 0,5 ml de PBS 1X , 1% fish gélatine puis sont reprises dans 10µl de PBS 1X.