1) Etude de la localisation de la Pol I dans des cellules WT et CARA lors d’un traitement à la rapamycine

Nous avons dans un premier temps étudié par immmunocytochimie la localisation de la Pol I dans des cellules WT et CARA lors d’une cinétique de traitement à la rapamycine. Rappelons qu’en l’absence de rapamycine, cette protéine a une localisation strictement nucléolaire dans des cellules en phase exponentielle de croissance.

Les cellules sont récoltées aux différents temps de la cinétique (0, 30, 120 et 240 minutes après l’ajout de la rapamycine) fixées au formaldéhyde (1% final), partiellement digérées à la zymolyase, puis incubées avec un anticorps polyclonal dirigé contre A190 la plus grande sous-unité de la Pol I.

Après analyse des cellules par microscopie à fluorescence, nous observons qu’au temps 0 de la cinétique, le signal généré par les anticorps anti-Pol I dans les souches WT et CARA forme une structure en croissant situé à l’un des deux pôles du noyau, caractéristique de la structure du nucléole chez la levure. Dans les cellules sauvages, dès 30 minutes de traitement à la rapamycine, nous observons un signal diffus dans le noyau qui correspond à une délocalisation de la Pol I du nucléole comme décrit dans la littérature (Oakes et al., 2006; Tsang et al., 2003).

Dans la souche CARA, la localisation de la Pol I ne semble pas affectée par la rapamycine pendant toute la durée du traitement (jusqu’à 4h) (Figure 22). Des résultats identiques pour les cellules CARA et Wt ont été obtenus en utilisant des anticorps dirigés contre d’autres sous-unités de Pol I (données non montrées).

Figure 22. Localisation nucléaire de la Pol I dans des cellules WT et CARA lors d’un traitement à la rapamycine

Lors d’une cinétique de traitement à la rapamycine, des aliquotes de cellules sont préleveés aux temps indiqués et analysées par immunohistochimie en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre la sous-unité A190 de la Pol I. Le signal bleu correspond à la coloration du noyau au DAPI et le signal rouge à l’anticorps secondaire dirigé contre l’anticorps anti A190. Au temps 0 (DO600

= 1) la rapamycine à une concentration de 0,5µg/ml est ajoutée dans le milieu de culture

Afin de déterminer si d’autres protéines nucléolaires présentaient une localisation sub- cellulaire différente dans les cellules Wt et CARA en présence de rapamycine, nous avons analysé la distribution de Nop 1 dans ces deux types de cellules en présence de cette drogue. Nop1, qui est l’homologue de la fibrillarine chez les mammifères, est un composant de la petite sous-unité du processome qui est requis pour la maturation de l’ARNr pre-18S (Dragon et al., 2002; Schimmang et al., 1989; Tollervey et al., 1991). En utilisant des anticorps dirigés contre la fibrillarine humaine qui reconnaissent la protéine Nop1 de levure (D. Hernandez-Verdun, communication personnelle), nous avons d’abord confirmé que la localisation de cette protéine était strictement nucléolaire dans les cellules WT et CARA en l’absence de rapamycine. Dès 30 minutes de traitement, la localisation de Nop1 est sensiblement modifiée dans les cellules WT. Bien que restant strictement nucléaire, la localisation de la protéine apparaît plus diffuse (et ceci pendant toute la durée de la cinétique. (Figure 23)

Figure 23. Localisation de la protéine Nop1 dans des cellules WT et CARA lors d’un traitement à la rapamycine

Lors d’une cinétique de traitement à la rapamycine, des aliquotes de cellules sont prélevées aux temps indiqués et analysées par immunohistochimie en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre la protéine Nop1. Le signal bleu correspond à la coloration du noyau au DAPI et le signal vert à l’anticorps secondaire dirigé contre l’anticorps anti Nop1.

Dans les cellules CARA, nous n’avons pas observé de modification de localisation de la protéine Nop 1 en l’absence ou en présence de rapamycine (Figure 23).

Les données obtenues avec la Pol I et avec Nop1 sont donc tout à fait comparables et suggèrent qu’une modification profonde de la structure du nucléole est induite par la rapamycine dans les cellules Wt mais pas dans les cellules CARA. Pour pousser plus loin la réflexion, on peut en fait se demander si la structure du nucléole demeure inchangée dans les cellules CARA en présence de rapamycine. Des observations de microscopie électronique réalisées en collaboration avec l’équipe de Denis Lafontaine (ULB, Belgique) confirment les données de microscopie optique. En l’absence de rapamycine, la structure du nucléole est comparable dans les cellules CARA et Wt (données non montrées). Après 2h de traitement en présence de cette drogue, on observe une déstructuration importante du nucléole dans les cellules Wt mais pas dans les cellules CARA. Ces données sont cependant trop préliminaires pour déterminer si l’ultrastructure du nucléole n’est pas du tout modifiée dans les cellules CARA en présence de rapamycine ou si des modifications structurales surviennent qui ne modifient cependant pas drastiquement la structure globale de ce territoire nucléaire.

Ces résultats peuvent être mis en regard de données antérieures obtenues au laboratoire quant à la localisation de la Pol I en fonction du stade de croissance des

cellules. Comme nous l’avons déjà mentionné, cette enzyme présente dans des cellules Wt ou CARA en phase exponentielle de croissance une localisation en forme de croissant, typique du nucléole. Dans des cellules Wt en phase stationnaire, nous n’observons pas de relocalisation diffuse de la Pol I dans tout le noyau comme c’est le cas en présence de rapamycine, mais au contraire une espèce de condensation de la Pol I dans une structure déjà décrite mais non caractérisée et localisée à un pôle du noyau (Figure 24). Dans les cellules CARA en phase stationnaire, aucune modification apparente de la localisation de la Pol I n’est observée (Figure 24).

Figure 24. Localisation nucléaire de la Pol I dans des cellules WT et CARA en phase de croissance exponentielle et stationnaire.

Des aliquotes de cellules sont prélevées en phase de croissance exponentielle et stationnaire, et analysées par immunohistochimie en utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre la sous- unité A190 de la Pol I. Le signal bleu correspond à la coloration du noyau au DAPI et le signal vert à l’anticorps secondaire dirigé contre l’anticorps anti A190.

Enfin des données récentes obtenues par Lei Zhou, chercheur post-doctoral au laboratoire, indiquent qu’en présence de cadmium (qui conduit également à une répression de la transcription Pol I), la structure du nucléole n’apparaît pas modifiée dans les cellules CARA alors qu’elle est fortement bouleversée dans les cellules Wt (données non montrées).

L’ensemble de ces observations suggère donc que dans différentes conditions conduisant à une répression de la transcription Pol I, on observe dans les cellules Wt mais pas dans les cellules CARA, une déstructuration massive du nucléole.

Comme indiqué dans l’introduction, le nucléole est un territoire nucléaire dynamique dont l’intégrité structurale nécessite une transcription Pol I active. Une explication triviale aux données décrites ci-dessus consisterait donc à imaginer que la dérépression partielle de l’activité Pol I mise en évidence dans les cellules CARA permettrait de conserver un niveau d’activité de transcription de l’ADNr suffisant pour maintenir au sein du noyau une structure nucléolaire canonique.

Afin de tester cette hypothèse, nous avons voulu comparer l’évolution du niveau d’activité Pol I dans les souches Wt et CARA pendant un traitement long à la rapamycine.

I-2) Etude de l’activité Pol I dans les cellules Wt et CARA lors d’un