2. BUT DU TRAVAIL
3.1.5. Le traitement permet l’acquisition d’une résistance à l’anoikis qui est augmentée chez les PLCs.
Nous nous sommes demandés si les PLCs avaient acquis des caractéristiques pouvant expliquer une résistance à une deuxième dose de sn38, une rechute ou l’apparition de métastases. Pour tester la sensibilité au sn38, nous avons réalisé des expériences de clonogénicité à partir des PLCs et des LS74T parentales. Aucune différence de sensibilité au sn38 n’a pu être mise en évidence (Figure 31A). Concernant l’implication des PLCs dans la possibilité d’une rechute, nous avons testé leur pouvoir tumorigénique via des expériences de xénogreffes. Après avoir injecté les cellules dans le flanc de souris
immuno-déficientes, nous avons mesuré la taille des tumeurs. Malgré le fort pourcentage de cellules sénescentes, les tumeurs générées à partir des PLCs sont de tailles très proches de celles générées à partir des LS174T parentales (Figure 31B). Au sein des tumeurs générées à partir des PLCs, les cellules mitotiques sont plus nombreuses et il y a moins de cellules nécrotiques que dans celles générées à partir des LS174T (Figures 31C et 31D). Les PLCs semblent donc avoir un plus fort pouvoir tumorigénique que les cellules parentales. Au vue de l’hétérogénéité des PLCs, ce résultat est difficile à interpréter. Des tests de dissémination métastatique sont en cours.
Figure 31 : Les PLCs n’ont pas acquis de résistance au sn38 en clonogénicité mais elles sont autant voire plus tumorigéniques que les cellules parentales. A. La sensibilité des LS174T parentales et des
PLCs au sn38 a été analysée par clonogénicité (n=3+/-sd). B. Evaluation de la croissance in vivo des cellules LS174T parentales et des PLCs. Les cellules ont été injectées en sous-cutané chez des souris immuno-déficientes, le volume tumoral a été mesuré durant une vingtaine de jours (n=6 +/- sd). C et D. Les tumeurs ont ensuite été fixées puis colorées H&E avant d’être observées au microscope (x40). Le nombre de cellules mitotiques (C.) et le pourcentage de cellules nécrotiques (D.) ont été quantifiés (n=6 +/- sd).
Enfin, nous avons testé la capacité des cellules à résister à l’anoikis. Nous avons déposé les cellules dans de l’agar, dont la température de fusion est faible, à 0,35% final. Les cellules sont alors en condition de faible adhérence. La survie et la prolifération dans ces conditions suggèrent une augmentation de la transformation cellulaire. Au bout d’une vingtaine de jours, le pourcentage de cellules capables de former des clones a été évalué. Le point non traité correspond à des cellules semées en RPMI 3% SVF pendant cinq jours. C’est le point contrôle du point traité sn38 pendant quatre jours, le traitement se faisant sur des cellules adhérentes, un jour après les avoir plantées. Le pourcentage de cellules capables de pousser dans ces conditions précises pour le point non traité est très faible (piste 1, Figure 32A). Notez que lorsque ces cellules sont cultivées en 10% SVF, ce pourcentage est augmentée. En revanche, pour les cellules traitées pendant quatre jours, ce pourcentage est environ de 0,06% (piste 2, Figure 32A). Cette capacité est donc induite par le traitement et ne correspond probablement pas à des cellules préexistantes. La
même observation est faite lorsque l’on remplace l’agar par un milieu riche en protéines de la matrice extra-cellulaire, plus proche des conditions physiologiques, le matrigel (Figure 32B). Dans cette matrice, 0,1% des cellules traitées forment des clones alors que ce pourcentage est nul pour les cellules non traitées. On ne peut probablement pas attribuer ce résultat à un enrichissement de cellules. En effet, dans les cellules LS174T, un traitement de quatre jours induit un arrêt du cycle cellulaire et le phénotype de sénescence (Figures 25 et 26). Et contrairement au processus apoptotique, qui est responsable de la disparition de cellules, lors du processus de sénescence les cellules ne disparaissent pas. Cela signifie que, si des cellules, capables de pousser dans ces conditions, étaient présentes avant le traitement, le pourcentage de cellules non traitées sur les Figures 32A et B serait probablement identique à celui des cellules traitées quatre jours. Le traitement au sn38 permet donc certainement l’acquisition de cette caractéristique de croissance en faible adhérence.
Figure 32 : Le traitement sn38 induit une résistante à l’anoikis qui est augmentée chez les PLCs. A et B. La capacité de croissance en faible adhérence des cellules LS174T non traitées, traitées quatre jours et
des PLCs a été évaluée dans du soft agar (A) ou dans du matrigel (B). 5 000 cellules ont été plantées pour chaque condition. Des photos représentatives sont présentées (x40) et le nombre de cellules formant des clones dans ces conditions a été quantifié après 10 à 20 jours (n=5 pour le soft agar et 8 pour le matrigel).
Dans les PLCs, le pourcentage de cellules capables de résister à l’anoikis est encore augmenté et atteint environ 1,2% (piste 3, Figure 32A). Cela signifie que ces cellules agressives se sont amplifiées après le changement de milieu, entre la condition quatre jours de traitement et la condition PLCs.
L’ensemble de ces résultats montrent que les PLCs n’ont pas acquis de résistance au sn38 (Figure 31A), cependant elles semblent conserver la capacité tumorigénique des cellules parentales in vivo (Figure 31B). De plus, elles ont une caractéristique des cellules métastatiques que n’ont pas les cellules parentales dans les conditions de l’expérience, la résistance à l’anoikis (Figure 32).
Pour conclure cette première partie, les cellules LS174T entrent donc en sénescence en réponse au traitement génotoxique comme le sn38 (Figure 25). Cependant, des cellules conservent leur capacité de prolifération et exerce cette capacité lorsqu’elle sont stimulées avec du sérum (Figures 26, 27 et 33). Des cellules proliférantes (PLD) émergent donc au milieu des cellules sénescentes (PLS). Ces cellules constituant la population totale sont qualifiées de cellules persistantes (PLCs). Ces cellules n’acquièrent pas de résistance au sn38 en clonogénicité mais elles pourraient être plus tumorigéniques que les cellules parentales (Figure 31). De plus, les cellules traitées par le sn38 avant la stimulation avec le sérum ainsi que les cellules PLCs acquièrent la capacité de croitre en faible adhérence (Figures 32 et 33).
Figure 33 : Echappement à la sénescence et acquisition de la résistance à l’anoikis suite au traitement par le sn38. Lors du traitement sn38, la majorité des cellules, dont la voie p53-p21 est
fonctionnelle, entrent en sénescence. Mais, lorsque les cellules traitées sont stimulées avec du sérum, une petite proportion de cellules sont capables de reproliférer. La persistance se caractérise par la coexistence de cellules proliférantes (PLD) et de cellules sénescentes (PLS). Les cellules traitées avec le sn38 et les PLCs ont une capacité de croissance en condition de faible adhérence qui est augmentée.
Nous nous sommes demandés de quels mécanismes dépendaient l’échappement à la sénescence et la résistance à l’anoikis. Nous nous sommes intéressés à trois notions ayant un lien avec la résistance à la chimiothérapie : les cellules souches cancéreuses, la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et les voies de survie.