Les facteurs d’EMT Slug et Zeb1, exprimés suite au traitement sn38, ne participent pas à la résistance à l’anoikis.

Dans un premier temps, nous avons étudié l’expression des marqueurs de l’EMT. La quantité d’ARN de la vimentine et du TGF-β augmente suite au traitement par le sn38 (pistes 1, 2, 5 et 6, Figure 36A). Au niveau protéique, l’E-cadhérine est très peu exprimée dans les LS174T parentales par rapport aux cellules HCT116 (pistes 1 et 2, Figure 36B). ce qui est déjà décrit dans la littérature (Gavert, Vivanti, Hazin, Brabletz, & Ben-Ze'ev, 2011). Cela signifie que les cellules LS174T ont déjà des caractéristiques mésenchymales. Les facteurs de transcription Twist1, Twist2 et Zeb2 ne sont pas exprimés dans les LS174T. En revanche dès deux jours de traitement, l’expression transcriptionnelle de Slug et Zeb1 est fortement induite (pistes 13, 14, 17 et 18, Figure 36C). Snail, un autre facteur de transcription de l’EMT, est aussi induit au niveau transcriptionnel, mais de façon plus faible (pistes 9 et 10, Figure 36C). L’ensemble de ces marqueurs d’EMT, excepté Snail, voit son expression transcriptionnel diminuer dans les PLCs (pistes 4 et 8, Figure 36A; pistes 12, 16 et 20, Figure 36C). Nous nous sommes intéressés à Slug et Zeb1 qui sont fortement induits en réponse au sn38. Au niveau protéique, les variations de Slug sont proches de celles de son ARN (Figure 36D). Zeb1 est une protéine de haut poids moléculaire. Le western blot étant difficile à réaliser, nous n’avons pas pu la détecter. Au vue des propriétés décrites des facteurs de transcription Slug et Zeb1, nous avons étudié leur implication dans le phénomène d’échappement à la sénescence induite par le traitement sn38 (Kurrey et al., 2009) (Tanno et al., 2010) (Smit & Peeper, 2011) (Sánchez- Tilló et al., 2013) (Siebzehnrubl et al., 2013) (Kao et al., 2014). L’utilisation d’ARN interférent a permis de diminuer l’expression de Slug mais nous n’avons pu montrer qu’une légère diminution de Zeb1 au niveau transcriptionnel (Figure 37).

Figure 36 : Expression de la vimentine, du TGF-β, de Snail, Slug et Zeb1 en réponse au traitement sn38 et dans les PLCs. A. L’expression transcriptionnelle de la vimentine et du TGF-β a été évaluée par

RT-PCR quantitative dans des cellules LS174T non traitées, traitées deux et quatre jours et dans les PLCs (n=2 pour sn38 2j, n=6 pour sn38 4j et n=3 pour les PLCs +/-sd). B. L’expression protéique de l’E-cadhérine et hsc70 a été évaluée par western blot sur des extraits totaux de cellules non traitées HCT116 et LS174T (n=2). C. L’expression transcriptionnelle de Snail, Slug et Zeb1 a été évaluée par RT-PCR quantitative dans des cellules LS174T non traitées, traitées deux et quatre jours et dans les PLCs (n=3 pour sn38 2j, n=5 pour sn38 4j et n=3 pour les PLCs +/-sd). D. L’expression protéique de l’E-cadhérine et hsc70 a été évaluée par western blot sur des extraits totaux de cellules LS174T non traitées, traitées deux et quatre jours et dans les PLCs (n=3).

La transfection de siRNA dirigés contre l’ARN de ces deux facteurs est réalisée 24h avant le traitement sn38. Les protocoles de traitement sont présentés sur la partie supérieure de la Figure 37. L’extinction de Slug induit une augmentation significative du nombre de cellules proliférantes au sein des PLCs (Figures 37A et 37E). Ce résultat peut signifier deux choses. Soit la perte de Slug induit l’émergence, la reprolifération, d’un nombre plus important de cellules, soit, le même nombre de cellules émergent mais celles qui émergent prolifèrent plus vite et donc sont plus nombreuses à ce temps. En revanche, aucune différence du pourcentage de cellules capables de proliférer en faible adhérence n’a pu être mise en évidence (Figure 37B).

Figure 37 : Slug et Zeb1 ne sont pas impliqués dans la résistance à l’anoikis mais Slug semble limiter le nombre de PLD au sein des PLCs. A et C. Des cellules transfectées avec un siRNA dirigé contre Slug

(A.) ou Zeb1 (C.) ou avec un siRNA contrôle ont été traitées pendant quatre jours et stimulées avec du nouveau milieu. Ces différentes conditions ont été décollées puis replantées suivant le protocole de clonogénicité. Des photos représentatives et la quantification sont présentées (n=5 pour Slug et n=2 pour Zeb1 +/-sd). B et D. Des cellules transfectées avec un siRNA dirigé contre Slug (B.) ou Zeb1 (D.) ou un siRNA contrôle, ont été traitées pendant quatre jours. La croissance en soft agar a ensuite été évaluée, 10000 cellules ont été plantées pour chaque condition. Des photos représentatives et la quantification sont présentées (n=9 +/- sd pour Slug et n=3 +/- sd pour Zeb1). E. L’expression de Slug et Zeb1 a été évaluée par western blot (n=3) ou par RT-PCR quantitative (n=2 +/-sd) après transfection des ARN interférents.

Après la transfection de l’ARN interférent de Zeb1, ni le pourcentage de cellules PLCs proliférantes, ni la pousse en agar ne sont modifiés (Figures 37C, 37D et 37E). Les résultats concernant Zeb1 doivent cependant être pris avec précaution car la perte protéique n’a pas été validée. La différence observée du nombre de PLCs proliférantes entre la condition contrôle et la condition ARN interférent de Slug pourrait être due au rôle de Slug dans le cycle cellulaire récemment décrit (J. Liu et al., 2010) (Mittal, Singh, Misra, & Chaudhuri, 2011) (W.-L. Wang et al., 2014b). Cependant, ces résultats montrent clairement que les facteurs de transcription Slug et Zeb1, induits après le traitement, ne sont pas impliqués dans le résistance à l’anoikis observée.

L’anoikis est une mécanisme de mort cellulaire dépendant de la perméabilisation mitochondriale (MOMP) et notamment de l’expression de Bim (Collins et al., 2005) (Galluzzi et al., 2012). Nous nous sommes donc demandés si les protéines anti- apoptotiques de la famille Bcl-2 pouvaient être impliquées dans la résistance à l’anoikis suite au traitement par le sn38. De plus, une étude réalisée au laboratoire a montré que la survie de cellules ayant échappées à la sénescence induite par l’oncogène Ras dépendait des protéines Mcl-1 et Bcl-xL (de Carné Trécesson et al., 2011). Nous avons donc aussi étudié la sensibilité des cellules à l’inhibition de ces protéines suite au traitement sn38.

3.2.3. Les facteurs de survie Bcl-xL et Mcl-1 sont nécessaires à