Les protéines Mcl-1, Bcl-xL et p21 sont impliquées dans l’échappement à la sénescence et dans la résistance à l’anoikis.

Un rôle passif pour Bcl-xL dans le processus de sénescence?

Nos résultats montrent que la protéine Bcl-xL est sur-exprimée en réponse au traitement lors de l’induction de la sénescence. Alors que Bcl-2 n’est pas exprimée, le traitement par l’ABT-737 combiné au sn38, ne suffit pas à induire la mort cellulaire des cellules LS174T contrairement aux cellules HCT116. L’ABT-737 inhibant Bcl-xL, cela semble signifier que cette protéine n’est pas essentielle au choix entre apoptose et sénescence dans les cellules LS174T. Cependant, dans ces expériences, nous avions traité les cellules avec l’ABT-737 seulement les vingt quatre dernières heures. Les deux traitements par le sn38 et l’ABT-737, utilisés en même temps pendant quatre jours, pourraient démasquer une sensibilité plus importante à la mort cellulaire. Dans les PLCs, c’est dans la population de cellules sénescentes PLS que l’expression de Bcl-xL est la plus forte. Au vue de l’importance des PLS dans les capacité de transformation des PLCs, il serait intéressant de connaitre leur sensibilité au traitement ABT-737 à ce temps tardif. D’autant plus que, lorsque Mcl-1 est inhibée, le traitement ABT-737 semble participer à l’inhibition de l’émergence des PLD et de la capacité de pousser en faible adhérence. Ces résultats confortent l’idée que les PLS, qui pourraient être les seules dépendantes de Bcl-xL, jouent un rôle essentiel dans le chimiorésistance et dans les capacités d’agressivité des PLD. Un rôle pour Mcl-1 dans l’échappement à la sénescence?

Nos résultats montrent que Mcl-1 est exprimée dans les cellules LS174T et que son expression ne semble pas varier de façon franche au cours de la réponse au traitement. Cependant, l’inhibition de Mcl-1 par ARN interférence induit la mort cellulaire d’une grande partie des cellules en réponse au sn38. Malgré le fait qu’elle ne soit pas nettement sur- exprimée dans les cellules traitées, Mcl-1 a donc un rôle essentiel dans l’inhibition de la mort cellulaire. Comme ce qui a été dit, le niveau expression des protéines de survie peut être considéré comme déterminant pour le choix entre apoptose et sénescence en réponse au traitement. Comme Bcl-xL, Mcl-1 pourrait favoriser le processus de sénescence de manière passive en bloquant l’apoptose lors de la catastrophe mitotique ou lors de la phase G1 suivante. L’expression de Bcl-xL et Mcl-1 serait alors associée à l’induction de la sénescence. Cependant, Mcl-1, et Bcl-xL dans une moindre mesure, ont aussi été décrits comme bloquant ce mécanisme suppresseur. L’équipe de Brian Gastman a en effet montré que la sur-expression de Mcl-1, inhibe la sénescence en réponse à la doxorubicine dans des cellules HCT116, dont la voie p53/p21 est fonctionnelle (Bolesta et

al., 2012). Le niveau d’expression de Mcl-1, décrit comme conditionnant la sensibilité à l’apoptose, module donc également la sénescence (Figure 53).

Dans notre modèle, l’expression de Mcl-1 semble régulée de manière différente dans les PLCs. Les cellules proliférantes PLD expriment un niveau plus important de Mcl-1 que les cellules sénescentes PLS. Dans les cellules PLD, la plus forte expression de Mcl-1 pourrait donc être reliée à leur capacité à échapper à la sénescence. Nos résultats montrent d’ailleurs que l’inhibition de Mcl-1, lors du traitement par le sn38, bloque le processus d’émergence des PLD. La perte de Mcl-1 pourrait à la fois sensibiliser les cellules à l’apoptose lors du traitement à un temps précoce mais elle pourrait donc aussi inhiber l’émergence des PLD. Alors que le rôle anti-apoptotique de Mcl-1 est très décrit, son rôle précis dans l’échappement à la sénescence reste à déterminer. L’équipe de Brian Gastman montre cependant que l’action «anti-sénescence» de Mcl-1 est indépendante de son action anti-apoptotique. En réponse au traitement, la sur-expression de formes mutantes de Mcl-1 ayant un domaine BH3 non fonctionnel n'altère en effet pas le blocage de la sénescence par Mcl-1. Les résultats présentés suggèrent que Mcl-1 pourrait inhiber l’action de p21 lors du processus de sénescence (Bolesta et al., 2012). Nos résultats n’apportent pas d’explication sur ce mécanisme mais ils appuient l’idée que Mcl-1 a un rôle essentiel dans l’échappement à cette suppression.

Figure 53 : Modèle présentant la réponse à la chimiothérapie en fonction du niveau d’expression des protéines Mcl-1 et Bcl-xL. Lorsque le niveau d’expression de ces protéines de survie est faible, les cellules

peuvent mourir en mitose ou à la sortie de mitose par apoptose. Un niveau modéré serait associé à l’induction de la sénescence alors qu’un niveau élevé pourrait permettre l’échappement à la mort cellulaire et la reprise de la prolifération.

La résistance à l’anoikis observée après le traitement par le sn38 semble aussi dépendre de l’expression de Mcl-1. L’anoikis est un processus de mort cellulaire dépendant de l’activation des caspases et donc de la perméabilisation mitochondriale par les protéines pro-apoptotiques. Le rôle des protéines Mcl-1 et Bcl-xL dans cette résistance peut donc être directement associé à leurs fonctions anti-apoptotiques. Combiné au rôle «anti- sénescence» de Mcl-1, les protéines de survie Mcl-1 et Bcl-xL pourraient jouer un rôle essentiel dans la rechute tumorale et l’acquisition de caractéristiques métastatiques suite à une chimiothérapie.

Un rôle pour p21 dans l’induction de la sénescence mais pas dans son maintien.

Le rôle précoce des protéines Bcl-xL et Mcl-1 est relativement passif en faveur de la sénescence. En revanche, p21 a un rôle actif dans l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à la chimiothérapie. Nos résultats montrent que les processus d’échappement et de résistance à l’anoikis dépendent de son induction précoce lors du traitement. p21 étant déterminant dans l’induction de la sénescence en réponse au traitement, cela signifie que la phénotype de sénescence et d’émergence des PLD sont intimement liés. De plus, les résultats montrant que l’inactivation de p21 induit une forte diminution de la croissance en faible adhérence suggèrent que cette capacité est reliée au phénotype de sénescence. Le fait que les cellules enrichies en PLS sont nécessaires à cette capacité conforte cette notion. Les travaux de Joan Brugge ont montré que la sur-expression de p21 pouvait conférer une résistance à l’anoikis (Collins et al., 2005). Dans ces conditions, le blocage du cycle en phase G1/S est associé à l’activation de ERK et à l’inhibition de l’expression de Bim, nécessaire à l’anoikis. De plus comme ce qui a déjà été dit, en tant qu’inhibiteur des complexes cycline/CDK, p21 inhibe indirectement l’expression des gènes cibles d’E2F1 tels que PUMA, Noxa et Bim. L’expression de p21 lors de l’induction de la sénescence permettrait donc le blocage du processus apoptotique dont dépend l’anoikis. La croissance en faible adhérence ne résulte pas uniquement de la résistance au processus apoptotique, en plus d’inhiber la mort cellulaire, il faut que les cellules soient capables de proliférer. Cette capacité proliférative peut difficilement être attribuée aux cellules sénescentes mais serait le fait des cellules PLD. Théoriquement les PLD devraient sous-exprimer p21 par rapport au PLS. De façon surprenante, entre les PLD et les PLS le niveau d’expression de p21 est identique. Nos résultats montrent que p21 est fortement induit à des temps précoces après l’administration du traitement mais son expression est diminuée dans les PLCs et également dans les PLS. A ce temps, le maintien de la sénescence dans les PLS pourrait dépendre d’autres voies comme celle de p16.

Le maintien de la sénescence pourrait dépendre de p16 dans les PLS.

p16 est une protéine associée au phénotype de sénescence. Contrairement à p21, elle n’interviendrait pas dans l’induction de la sénescence mais plutôt dans son maintien. Dans les cellules LS174T et en réponse au sn38, son expression pourrait intervenir tardivement après la génération des dommages (Poele et al., 2002). L’expression de p16 pourrait théoriquement dépendre de l’inhibition de l’expression d’EZH2. EZH2 fait partie du complexe de répression transcriptionnelle des Polycomb. En méthylant le locus INK4a/ ARF, il est responsable de l’inhibition de l’expression de p16. EZH2 étant une cible transcriptionnelle des protéines E2F, p21 participe à l’inhibition de son expression comme ce qui a été dit dans l’introduction (Figure 20). Au laboratoire, un autre étudiant en thèse, Julien Gouju, a montré que l’expression transcriptionnelle de EZH2 était diminuée en réponse au sn38 et dans les PLCs (Figure 54A). En revanche, dans les PLD, son expression est plus importante que dans les PLS et retrouve un niveau proche de celui des cellules LS174T parentales (Figure 54B). Il serait donc intéressant d’étudier l’expression de p16 dans ces deux populations. Une différence entre les PLD et les PLS pourrait donc être leur capacité à induire p16. L’induction de p16 pourrait permettre aux cellules PLS de maintenir leur phénotype de sénescence grâce à un faible niveau d’expression d’EZH2. En revanche, les cellules à l’origine des PLD pourraient sur- exprimer EZH2 et être incapables d’exprimer p16. Cette différence de régulation de p16 pourrait expliquer l’échappement à la sénescence observé. Ces hypothèses constituent une piste intéressante à tester.

Figure 54 : Expression d’EZH2 en réponse au traitement sn38 et dans les PLCs. A. et B. L’expression

transcriptionnelle d’EZH2 a été évaluée par RT-PCR quantitative dans des cellules LS174T non traitées, traitées quatre jours et dans les PLCs (n=3 +/-sd) (A.). Elle a aussi été évaluée dans les cellules PLD et PLS enrichies après tri (n=4 +/-sd) (B.). Ces résultats ont été obtenus par Julien Gouju.

Entre apoptose, sénescence et échappement aux mécanismes de suppression, le choix dépend en partie de l’expression et de l’activation des protéines Bcl-xL, Mcl-1, p21 et p16. Dans notre modèle, en réponse au traitement, l’expression relative de Bcl-xL, Mcl-1 et p21 sensibiliserait la majorité des cellules à la sénescence. L’inactivation de ces protéines limite de façon paradoxale l’échappement à la sénescence et la croissance en faible adhérence. De futurs travaux doivent mieux caractériser la régulation de ces protéines dans les deux-sous populations PLD et PLS de façon à mieux comprendre leur implication dans la chimiorésistance.