Les PLCs sont constituées de PLD et de PLS qui peuvent être enrichies selon leur granulométrie et leur taille.

La séparation des cellules sur le critère de la sénescence est assez compliquée. En effet il n’y pas de marqueurs extra-cellulaires connus. Une solution est de séparer les cellules selon leur granulométrie et leur taille. En effet, lors du processus de sénescence la morphologie des cellules change de façon importante (Schmitt, 2007).

Figure 44 : La granulométrie et la taille des cellules PLCs sont augmentées par rapport aux cellules LS174T parentales. Les cellules LS174T et les PLCS ont été

analysées par cytométrie de flux selon les paramètres SSC (granulométrie) et FSC (taille). Des images représentatives de six expériences sont présentées.

Lorsque que l’on compare le profil cytométrique granulométrie (SSC)/taille (FSC) des cellules LS174T parentales et des PLCs, nous observons de façon très nette une augmentation de ces paramètres SSC/FSC (Figure 44). Alors que nos résultats semblent indiquer que les PLD sont des cellules diploïdes et que les PLS sont des cellules tétraploïdes et polyploïdes (Figures 25 et 30), nous avons décidé de séparer les cellules PLD et PLS selon leur profil SSC/FSC. Pour vérifier la pertinence de cette démarche de séparation, nous avons étudié des marqueurs de prolifération et de sénescence dans les sous-populations cellulaires SSClow_/FSClow _{et SSC}high_/FSChigh_.

Pour cela, dans un premier temps, nous avons réalisé un marquage de la protéine Ki67 sur la population totale PLCs (Figure 45A). Initialement utilisé en histologie, le marquage de la protéine Ki67 identifie de façon robuste la prolifération, même si le rôle précis de cette protéine n’est pas connu (Brown & Gatter, 2002) (Pathmanathan & Balleine, 2013). Suite au marquage, nous avons sélectionné les deux populations et étudié leur expression de Ki67. Les cellules SSClow_/FSClow _{(en vert) sont bien marquées, ce sont des cellules} proliférantes alors que les SSChigh_/FSChigh _{(en rouge) n’expriment pas ou très peu la} protéine Ki67 (Figure 45A). Nous avons ensuite séparé ces cellules pour confirmer cette

observation faite sur la population totale. Les expériences de clonogénicité, réalisées après le tri, révèlent que les cellules SSClow_/FSClow _{sont significativement enrichies en} cellules proliférantes (pistes 1 et 2, Figure 45B) et de façon inverse, les cellules SSChigh_/ FSChigh _{sont significativement déplétées en cellules proliférantes (pistes 1 et 3, Figure} 45B). Suite au traitement génotoxique, l’arrêt du cycle cellulaire est associé à la perte de l’expression transcriptionnelle de AURKA (Courapied et al., 2010) (C.-C. Wu et al., 2012). Nous avons donc étudié l’expression de ce marqueur et celle de PLK1, une protéine intervenant dans la prolifération qui est également diminuée lors des dommages de l’ADN (McKenzie et al., 2010) (Zhou et al., 2013) (Y.-C. Lin et al., 2014). L’expression transcriptionnelle de AURKA et PLK1 est augmentée significativement dans les cellules SSClow_/FSClow _{par rapport aux cellules SSC}high_/FSChigh _{(Figure 45C).}

Figure 45 : Au sein des PLCs, les cellules SSClow_/FSClow _{expriment des marqueurs de prolifération. A.}

La prolifération des PLCs a été évaluée par cytométrie en utilisant un anticorps dirigé contre le Ki67. Nous avons sélectionné les populations SSClow_/FSClow _{et SSC}high_/FSChigh_{, et leur expression du Ki67 est} présentée. Le pourcentage des cellules exprimant le Ki67 est présenté à droite (n=4+/-sd). B. Les capacités prolifératives des cellules SSClow_/FSClow _{et SSC}high_/FSChigh _{triées ont été évaluées par clonogénicité après tri} (n=4+/-sd). C. L’expression transcriptionnelle de AURKA et PLK1 a été évaluée par RT-PCR quantitative dans chaque population après tri (n=5+/-sd).

Ces résultats valident l’enrichissement des PLD dans la fraction SSClow_/FSClow_{. Nous} avons ensuite étudié les marqueurs de sénescence dans les deux populations.

Le marquage de l’activité de la SA-β-galactosidase a été réalisée après le tri sur les deux populations. De façon significative, la fraction de cellules SSClow_/FSClow _{est enrichie en} cellules n’ayant pas d’activité SA-β-galactosidase (piste 1 et 2, Figure 46A). L’enrichissement des cellules SSChigh_/FSChigh _{en cellules sénescentes est observé de} manière très significative (piste 1 et 3, Figure 46A). Il faut noter la différence du pourcentage de cellules sénescentes au sein des PLCs entre les résultats présentés sur les Figures 26 et 46 qui sont respectivement de 70 et 55% environ. Contrairement à la Figure 26, dans la Figure 46, les cellules PLCs correspondent à des cellules qui ont été passées dans le trieur, sans critères de tri. Cette procédure a pu diminuer la viabilité de ces cellules et c’est pour cette raison que nous l’avons utilisé comme contrôle.

Nous avons aussi étudié l’expression p21, le médiateur de la sénescence. Dans les cellules SSChigh_/FSChigh_{, p21 est sur-exprimé par rapport aux cellules SSC}low_/FSClow uniquement au niveau transcriptionnel (Figure 46B). Le niveau protéique de p21 est identique entre les sous-populations (Figure 46C). A ce temps tardif après l’induction de la sénescence, p21 est exprimé plus faiblement qu’après deux jours de traitement (Figure 46C; pistes 2 et 4, Figure 46D). Dans les PLS constituant les PLCs, la sénescence pourrait être maintenue par p16 comme le suggère une autre étude (Poele et al., 2002).

Figure 46 : Au sein des PLCs, ce sont les cellules SSChigh_/FSChigh _{qui activent la SA-β-galactosidase.} A. Les cellules SSClow_/FSClow _{et SSC}high_/FSChigh _{ont été triées par cytométrie et le pourcentage de cellules} ayant une activité de la SA-β-galactosidase a été évalué pour chaque sous-population (n=8+/-sd). Des photos représentatives sont montrées sur la partie droite de la figure (x100). B et C. L’expression transcriptionnelle et protéique de p21 a été évaluée par RT-PCR quantitative (B.) et par western blot (C.) dans chaque population après tri (n=5+/-sd). D. L’expression de p21 a été évaluée par western blot sur des extraits totaux de cellules LS174T non traitées, traitées deux et quatre jours et de PLCs (n=3).

Les résultats, présentés sur les Figures 45 et 46, nous permettent d’identifier les cellules SSClow_/FSClow _{comme enrichies en PLD et les cellules SSC}high_/FSChigh _{comme enrichies} en PLS. Nous avons ensuite poursuivi la caractérisation des sous-populations en analysant la ploïdie des PLD et des PLS.