Nous proposons ici est de partir avec des algorithmes de tomographie a n de pouvoir recons- truire le volume complet observé. L'étude avait pour but de proposer une méthode permettant d'obtenir une image en trois dimensions avec moins d'acquisitions que si le volume avait été
acquis en microscopie deux photons classique plan par plan, le tout avec la meilleure résolution possible.
3.2.1 Dé nition et histoire
La tomographie est une technique d'imagerie principalement utilisée dans le domaine médical pour de l'imagerie 3D dont le principe de base est la reconstruction d'un volume 3D à partir de projections 2D. Dans le domaine médical on utilise, entre autres, comme outil de projection, les rayons X dans le cas des scanners (CT scan pour computerized tomography scan), les positrons pour l'imagerie PET (Positron Emission Tomography), le rayonnement infrarouge pour la tomographie optique cohérente (OCT : Optical coherence tomography). La tomographie est également utilisée en sismologie, i.e. la tomographie sismique, qui utilise les tremblements de terre pour reconstruire la structure interne de la terre ainsi que ses propriétés physiques. Les algorithmes de tomographie appartiennent tous au domaine des problèmes inverses (au même titre que la déconvolution) et il en existe un grand nombre diérent pour chaque appli- cation.
Pour plus de détails sur les méthodes de tomographie et leurs applications voir [224227].
3.2.2 Projection et rétroprojection
Pour mieux saisir les enjeux de la tomographie, il est essentiel de bien comprendre ce qu'est une projection et de bien faire la diérence entre projection et coupe. La g. 3.2-A montre, avec un schéma simpli é, la diérence entre des coupes, ou sections, d'un volume (S1 et S2) et la projection de ce volume (P), ici selon la direction horizontale. Une section représente ici une partie du volume, un simple plan, alors que la projection est une sommation (intégrale) de la totalité des éléments du volume selon une direction. A la g. 3.2-B sont présentés deux exemples de projections : une première projection d'une image 2D vers une ligne 1D, et une projection d'un volume 3D vers une image 2D. Lorsqu'on parle de projection, il est toujours question de représenter la scène dans un espace de dimension moindre.
En tomographie, il est important de dé nir un bon modèle de projection. Ce modèle de projection a pour but de décrire au mieux le phénomène d'acquisition d'image. Dans l'imagerie médicale c'est, par exemple, le phénomène d'absorption des rayons X par les diérents tissus du corps humain. Le modèle de projection que nous allons utiliser ici est un modèle assez classique : le modèle de la transformée de Radon [228].
La transformée de Radon, ou théorème de projection de Radon, est une transformée intégrale qui dé nit une série de projections. La transformée de Radon fut proposée pour la première fois par Johann Radon [228]. L'équation suivante dé nit la transformée intégrale de Radon :
Projection 2D to 1D
Projection 3D to 2D
A
B
Figure 3.2 A] Vue simpli ée des diérences entre section (S1 et S2) et projection (P).
B] Exemples de projections d'un fantôme dit de Shepp-Logan (donnée simulée couramment utilisée en tomographie) d'une image 2D vers une ligne 1D, puis d'un volume 3D vers une image 2D.
Rf (L) = Z
L
f (x) |dx| (3.1)
Rf représente la transformée de Radon, L, l'ensemble des lignes échantillonnant l'espace consi- déré. Concrètement, la transformée de Radon décrit l'ensemble des projections intégrales selon toutes les directions permettant une projection. Cette équation a initialement été dé nie pour des projections d'espaces de dimension 2 à des espaces de dimension 1 mais a depuis été généralisée pour des projections d'espaces de dimension N à des espaces de dimension N-1. Les données ainsi obtenues après une transformée de Radon représentent la totalité des pro- jections eectuées de l'espace objet. En pratique, sur des données numériques, l'intégrale est souvent traduite en somme d'éléments nis. Cet ensemble de projections est souvent appelé un sinogramme ( g. 3.3).
La g. 3.4-A montre, en exemple, une série de projections en une dimension d'une image en deux dimensions. Maintenant que nous avons notre série de projections, il est temps de passer à la reconstruction. Le but est de retrouver notre volume initial uniquement avec les informations contenues dans les projections.
La méthode la plus simple, qui permet une reconstruction tomographique, est la méthode de rétroprojection. Cette méthode consiste à prendre les projections contenues dans le sino- gramme et à les propager dans la direction selon laquelle elles ont été projetées pour obtenir un objet de la bonne dimension (2D vers 3D). Ces projections étalées sont ensuite sommées pour obtenir une reconstruction de l'objet. Un exemple de reconstruction par rétroprojection simple est présenté à la g. 3.4-B.
Projection angle
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Pixel position on the detector
-150 -100 -50 0 50 100 150 180 intenisy 0 Max Sinogram of 2D to 1D projections
Figure 3.3 Un exemple de sinogramme des projections du fantôme Shepp-Logan 2D. Chaque colonne représente une projection à un angle bien particulier.
fréquentielle est de moins en moins complète à mesure qu'on s'éloigne du centre de l'image. Ce manque d'informations de hautes fréquences va inévitablement dégrader le résultat car la reconstruction agira également comme un ltre passe bas. Ainsi, une grande partie des détails seront perdus. Pour pallier ce problème, l'utilisation de ltres permet d'ampli er les hautes fréquences. Le ltre le plus courant est le ltre rampe de base, bien qu'il ait tendance à ampli er le bruit de haute fréquence. Étant donné la tendance du ltre rampe à ampli er les hautes fréquences, il est souvent combiné à un ltre passe bas (du type Butterworth ou Hanning). Un certain nombre de ces ltres sont étudiés en [224,229,230]. Pour tirer pro t de ces diérents ltres permettant d'améliorer la reconstruction, la méthode de rétroprojection ltrée est utilisée.
La méthode classique de rétroprojection ltrée utilise des ltres pour pré- ltrer chacune des projections du sinogramme avant de procéder à la rétroprojection. Cette étape de pré- ltrage permet d'ampli er certains contenus en hautes fréquences des projections pour compenser le manque de couverture fréquentielle. La g.3.4-B montre un exemple de rétroprojection ltrée comparé à un exemple de rétroprojection simple sur la reconstruction d'une image en deux dimensions.
3.2.3 Les faisceaux Bessel-Gauss comme moyen de projection
Dans cette section, nous allons présenter le modèle de projection que nous allons utiliser. Il est basé sur l'utilisation des faisceaux Bessel-Gauss en microscopie de uorescence deux photons à balayage laser.
En microscopie confocale, le sectionnement optique est donné par le sténopé du microscope (comme présenté en section 0.1.5). La microscopie deux photons utilise l'eet deux photons pour obtenir un sectionnement optique identique à la microscopie confocale. La microscopie
Proj. 1 Proj. 2 Proj. 3 Proj. filtered 3 Reconstruction Projection
With 3 proj. With a lot of proj. Proj. 1 Proj. 2 Proj. 3
A
B
Figure 3.4 A] Exemple de projection d'un objet en deux dimensions donnant des vecteurs en une dimension. B] Reconstruction par rétroprojection simple comparée à une reconstruction par rétroprojection ltrée à l'aide d'un ltre rampe. On remarque que, non seulement un grand nombre de projections est nécessaire pour reconstruire correctement l'objet, mais en plus le ltrage est nécessaire pour éliminer le ou de la reconstruction. Figures adaptées de [231]
deux photons est basée sur l'eet d'absorption multiphotonique (deux photons dans ce cas). Comme présenté en [197], nous proposons d'utiliser des faisceaux Bessel-Gauss proposant une profondeur de champ étendue en microscopie deux photons comme moyen de projection. Ces faisceaux Bessel-Gauss permettent d'obtenir sur une image, l'intégration du volume selon la direction de focalisation du faisceau Bessel-Gauss. Étant donné la possibilité de générer des faisceaux Bessel-Gauss focalisés avec un angle, un certain nombre de projections pourront être acquises successivement pour construire notre sinogramme.
La g. 3.5 montre en exemple un faisceau Bessel-Gauss à angle. Le faisceau Bessel-Gauss va exciter les molécules uorescentes de l'échantillon sur toute sa longueur. On se retrouve ainsi à intégrer toute la uorescence provenant de la ligne du faisceau Bessel-Gauss en un point. Le balayage laser permet de construire une image en deux dimensions représentant une projection du volume observée selon la direction de focalisation du faisceau Bessel-Gauss.
Maintenant que nous savons qu'il est possible de créer des faisceaux Bessel-Gauss à angle et d'obtenir ainsi une projection de l'échantillon selon l'axe de focalisation du faisceau Bessel- Gauss en microscopie deux photons, nous devons dé nir des angles de projection réalistes. Ces angles de projection sont dé nis en fonction de l'ouverture numérique de l'objectif du microscope. Cette ouverture numérique nous donne une limite quant à l'angle maximal avec lequel on pourrait focaliser un faisceau Bessel-Gauss. La g. 3.6-A montre l'angle de focali- sation maximal du faisceau Bessel-Gauss et à la g. 3.6-B nous montrons l'échantillonnage des angles que nous proposons d'utiliser pour nos projections. Nous avons choisi d'utiliser une vingtaine d'angles de projection répartis azimutalement sur deux cercles concentriques repré-
Emited light Bessel-Gauss excitation beam 3D object Detector (PMT) Objective
Figure 3.5 Schéma montrant le faisceau Bessel-Gauss en tant que moyen de projection. La totalité de la uorescence émise dans la zone focale étendue du faisceau Bessel-Gauss est intégrée par le détecteur.
sentant deux angles radiaux diérents (l'angle maximal dé ni par l'ouverture numérique et sa moitié). θ = 45° θ = 25° Projections φ = 36° Optical axis
Sample plane Maximum angle
(defined by NA) Bessel-Gauss beam at θ=0° Bessel-Gauss beam at θ=45° Objective
A
B
Figure 3.6 A] Exemple de faisceaux Bessel-Gauss focalisés droit et à l'angle maximal autorisé par l'ouverture numérique (NA = 1.2). B] Représentation des angles de focalisation proposés pour pro ter au maximum de l'ouverture numérique tout en minimisant le nombre de projections.
En plus du ou ajouté à la reconstruction par le manque de couverture fréquentielle, le faisceau Bessel-Gauss lui-même ajoute un ou à chacune des projections. En eet, lors de l'acquisi- tion d'une projection, chaque plan du volume projeté est convolué par la PSF transversale du faisceau Bessel-Gauss. De plus, étant donné que le faisceau Bessel-Gauss a un pro l gaussien selon l'axe optique (dans la longueur du faisceau Bessel-Gauss), la projection n'est pas tota-
lement uniforme. Les éléments uorescents dans le plan central seront excités par la partie du faisceau Bessel-Gauss la plus intense, alors que ceux éloignés du plan central seront excités par la partie la moins intense du faisceau Bessel-Gauss. La g. 3.7représente une simulation de la PSF du faisceau Bessel-Gauss en microscopie deux photons. Pour construire cette es- timation de la PSF, nous avons simplement étalé la PSF présentée en section 1.2.1 en trois dimensions suivant un pro l gaussien. La coupe transversale de la PSF donne un pro l suivant une fonction de Bessel au carré et la coupe sagittale à un pro l gaussien.
Transverses Sagittales Plan sagittal Plan transverse Faisceau Bessel-Gauss
A
B
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Coupes 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9Figure 3.7 A] Représentation schématique du faisceau Bessel-Gauss focalisé ainsi que les plans de coupe utilisés en B]. B] Coupes transversales et sagittales de la PSF simulée du faisceau Bessel-Gauss.
Étant donné que les projections ont subi une convolution par une PSF du type du faisceau Bessel-Gauss présentée en section 1.2.1, nous proposons de déconvoluer les projections avant de procéder à la reconstruction. Pour cela, nous allons dans un premier temps utiliser le ltre de Wiener (éq. (2.2)) comme ltre déconvolutif, et nous allons le combiner au ltre rampe. Le but est de remplacer le ltre passe bas, souvent combiné au ltre rampe, par le ltre de Wiener. Ce ltre déconvolutif permet d'inverser la convolution des projections avec la PSF du faisceau Bessel-Gauss.
3.3 Caractérisation de l'algorithme et simulations
Pour caractériser la reconstruction et pouvoir estimer la faisabilité de cette méthode d'ima- gerie, nous avons dans un premier temps testé plusieurs reconstructions de rétroprojections sur un modèle simulé de Shepp-Logan en trois dimensions. La g. 3.8-A montre une coupe du Shepp-Logan 3D simulé ainsi qu'une coupe du faisceau Bessel-Gauss, considérée comme la PSF des projections. Le modèle de Shepp-Logan 3D et celui du faisceau Bessel-Gauss font tous deux 512x512x256 pixels. Le faisceau Bessel-Gauss a une largeur à mi-hauteur de 14 pixels. La g.3.8-B montre les 20 projections obtenues en suivant les angles dé nis à la g.3.6. Comme on peut le remarquer, chacune des projections est rendue oue, non seulement par l'opération
de projection elle-même mais également par la PSF du faisceau Bessel-Gauss. Dans les gures 3.8-(B), les projections sont représentées sans bruit. Le bruit est ajouté ensuite pour simuler l'acquisition par un microscope. Le bruit ajouté est un bruit gaussien de moyenne 0.002 et de variance 0.005 en utilisant la fonction imnoise de Matlab.
θ = 45° θ = 25° φ = 0 to 144° ° φ = 180 to 324° ° φ = 0 to 144° ° φ = 180 to 324° ° Coupe des données Coupe du faisceau Bessel-Gauss (PSF)
A
B
Figure 3.8 Simulation des projections avec faisceaux Bessel-Gauss. A] Image d'une coupe du Shepp-Logan 3D ainsi qu'une coupe de la PSF du faisceau Bessel-Gauss. B] Projections du Shepp-Logan 3D obtenues avec le faisceau Bessel-Gauss simulé. Les angles listés sont re- présentés à la g.3.6.
La g.3.9montre plusieurs résultats de reconstruction par rétroprojections. La première ligne compare une coupe de l'objet original avec une projection, puis une coupe d'une rétropro- jection simple, sans ltre. La rétroprojection simple permet de reconstruire l'objet, mais le résultat reste fortement dégradé. La seconde ligne montre trois exemples de coupes de recons- truction par rétroprojection ltrée utilisant diérents ltres. Le premier est un ltre rampe qui ampli e les haute fréquences, dans le but de combler le manque de couverture fréquentielle. On remarque cependant que, dans le cas de projections bruitées, le ltre rampe a tendance à trop ampli er certaines fréquences et à ampli er le bruit, ce qui donne une reconstruction fortement dégradée. C'est pour cela que le ltre rampe est souvent combiné à un autre ltre, un ltre passe bas tel que le ltre Butterworth.
Le ltre Butterworth est un ltre passe bas dont l'équation est :
B (u) = 1
1 +uu c
2n (3.2)
avec u la fréquence spatiale, uc la fréquence de coupure du ltre, et n l'ordre du ltre. La
fréquence de coupure est sélectionnée pour minimiser le bruit dans la reconstruction nale et l'ordre donne la force de la coupure des fréquences au-delà de la fréquence de coupure, ceci
permettant de ltrer le bruit tout en gardant un certain détail de l'objet reconstruit. Dans la g. 3.9, le ltre Butterworth a une fréquence de coupure réduite de 0.025 et un ordre de 3. La coupe de la rétroprojection eectuée avec une combinaison des ltres rampe et Butterworth donne un résultat plus détaillé et proche de l'objet réel qu'une simple rétroprojection. Pour la dernière coupe de reconstruction présentée, le ltre Butterworth est remplacé par un ltre de Wiener pour contrer plus e cacement le fait que chaque projection acquise est en plus convoluée avec la PSF du faisceau Bessel-Gauss. En observant la coupe de la rétroprojection utilisant une combinaison des ltres rampes et de Wiener, on remarque que le résultat n'est pas si diérent du résultat précédant utilisant la combinaison de ltres rampes et Butterworth. Cela peut s'expliquer par le fait que les deux ltres ont des expressions similaires et que la diérence apportée par la prise en compte de la PSF du faisceau Bessel-Gauss n'est pas su sante pour diérencier les deux ltres. Pour améliorer les résultats obtenus ici, il faudrait changer de méthode de reconstruction en tomographie et remplacer le ltre de Wiener pour une méthode de déconvolution plus e cace. Cette proposition sera détaillée dans la dernière section de ce chapitre.
Original Projection Rétroprojection
Rétroprojection filtrée rampe Rétroprojection filtrée Butterworth + rampe Rétroprojection filtrée Wiener + rampe
Figure 3.9 Résultats de reconstruction par rétroprojection et rétroprojection ltrée. La ligne du haut montre dans l'ordre de gauche à droite : une coupe de l'image originale, une projection de l'image originale, une coupe de l'image obtenue par rétroprojection simple. La ligne du bas montre des coupes de l'image reconstruite par rétroprojection ltrée. Dans l'ordre de gauche à droite nous voyons : l'image avec le ltre rampe seul, l'image avec le ltre rampe combiné au ltre Butterworth et l'image avec le ltre rampe combiné au ltre de Wiener. Dans la section suivante nous allons décrire une méthode expérimentale permettant d'obtenir des projections compatibles avec la reconstruction tomographique présentée ici.