Après avoir comparé et analysé les diérentes méthodes de superrésolution, nous avons re- marqué qu'il reste un vide à combler lorsqu'il s'agit d'augmenter la résolution en microscopie optique sans ajouter de contraintes limitant fortement le champ d'application. Beaucoup de méthodes de superrésolution nécessitent des modi cations complexes et coûteuses des micro- scopes optiques classiques, certaines sont très dépendantes des molécules uorescentes dispo- nibles, et un grand nombre d'entre elles restreignent fortement le type et la taille des échan- tillons biologiques observables.
L'objectif principal de cette thèse est de développer des méthodes d'augmentation de réso- lution alternatives aux méthodes de microscopie optique de superrésolution classiques. Notre travail se restreint aux méthodes de microscopie optique pour garder la possibilité d'imager des structures biologiques vivantes, ce qui n'est pas possible en microscopie électronique. La plupart des méthodes de superrésolution existantes cherchent à obtenir la meilleure résolution possible quel que soit le prix ; de ce fait, ces méthodes restreignent leur champ d'application par rapport à la microscopie optique classique. C'est ce manque que nous tenterons de com- bler ici, en proposant des méthodes d'augmentation de résolution qui sont compatibles avec la microscopie optique classique, dans notre cas, la microscopie confocale, et avec l'observa- tion d'échantillons biologiques. La méthode SLAM précédemment publiée nous servira de base pour une partie de notre étude.
La première approche proposée permettant d'orir une méthode de superrésolution alternative est l'utilisation d'un autre type de faisceau laser pour le balayage en microscopie confocale. Ce changement de faisceau laser permet une augmentation de résolution sans changement sur le principe de fonctionnement d'un microscope confocal ; seule la source laser est modi ée. De plus, les faisceaux laser proposés sont compatibles avec la méthode SLAM (cf section0.2.8), ce qui permet de proposer une amélioration de cette dernière sans ajouter de contrainte d'appli- cation sur microscope utilisé. Contrairement à la plupart des méthodes de superrésolution qui nécessitent des modi cations importantes sur le microscope ajoutant aux contraintes d'utili- sation et d'applications, l'approche proposée reste une approche de microscopie confocale avec tous les avantages qui y sont liés.
Dans un second temps, nous proposons une méthode alternative à la méthode SLAM en remplaçant le post-traitement de cette dernière par une méthode de déconvolution. Cette amélioration de la méthode SLAM ne requiert aucune modi cation supplémentaire sur le microscope que celle nécessaire pour la méthode SLAM et conserve donc tous les avantages de la microscopie confocale, à savoir notamment sa simplicité, ses capacités d'observation d'échantillon vivant et en plusieurs couleurs.
Dans un troisième chapitre, nous étudions une autre approche de microscopie optique pour améliorer un autre aspect des microscopes optiques, à savoir les dimensions du champ de vue. Nous étudions de manière théorique une méthode de microscopie permettant d'imager un grand volume avec un minimum de compromis sur la résolution et la vitesse d'acquisition. Pour cela, nous utilisons une autre propriété des faisceaux laser présentés dans les chapitres 1 et2 et nous utiliserons un algorithme de tomographie pour reconstruire les images en trois dimensions.
Chapitre 1
Les faisceaux Bessel-Gauss en
microscopie confocale
L'objectif de ce projet est d'utiliser les faisceaux Bessel-Gauss comme faisceaux laser d'excita- tion en microscopie confocale dans le but d'augmenter la résolution de ce type de microscope. De plus l'utilisation de polarisations spéci ques nous a permis de générer diérents faisceaux Bessel-Gauss compatibles avec la méthode d'augmentation de résolution SLAM, que nous avons donc améliorée.
1.1 Les faisceaux Bessel-Gauss et leurs utilisations
Les faisceaux Bessel ont l'avantage de combiner une longue profondeur de champ avec une faible largeur à mi-hauteur au point focal. Les faisceaux Bessel sont des solutions exactes à l'équation d'onde d'Helmholtz transportant une quantité in nie d'énergie. Ils ne peuvent donc exister physiquement. Les faisceaux Bessel-Gauss sont l'équivalent des faisceaux Bessel ayant une énergie nie. Ils conservent les propriétés les plus intéressantes des faisceaux Bessel, à savoir une longue profondeur de champ et un point focal n, mais sur une distance nie. Du fait de leur faible divergence [168,169] et de leur auto-reconstruction [170,171] les faisceaux Bessel sont utilisés dans un grand nombre d'approches de microscopie telles que la microscopie à feuillet de lumière [172,173], la microscopie à profondeur de champ augmentée [174177] et les pièges à particules [178]. Ces faisceaux ont aussi été utilisés récemment en microscopie CARS (Coherent Anti-Stokes Raman Scattering) pour augmenter la résolution et en microscopie STED (STimulated Emission Depletion) pour conserver la même résolution sur une grande distance lors de l'imagerie d'échantillons épais [179] ou pour du STED à feuillet de lumière [180].
Du fait du plus petit point focal exhibé par les faisceaux Bessel, et par extension par les faisceaux Bessel-Gauss, leur utilisation en microscopie par balayage laser peut mener à une
augmentation de résolution du microscope. Notre objectif est d'utiliser les faisceaux Bessel- Gauss dans un microscope confocal pour obtenir cette augmentation de résolution transversale. Certains ont déjà utilisé des faisceaux Laguerre-Gauss d'ordre élevé en polarisation radiale, qui sont asymptotiquement équivalents aux faisceaux Bessel-Gauss en imagerie confocale [181 183]. Cependant, la présence de résidus des lobes secondaires dégrade souvent les images. Une solution au problème des lobes secondaires serait l'utilisation de l'eet deux photons en incorporant le faisceau Bessel-Gauss dans un microscope deux photons. L'énergie présente dans les lobes secondaires en serait grandement diminuée et on imagerait avec une grande profondeur de champ [174].
La solution proposée ici est l'utilisation du sténopé du microscope confocal pour éliminer, à la détection, la uorescence provenant des lobes secondaires et ne garder que la uorescence du lobe central. L'utilisation du sténopé nous permet de garder le sectionnement optique donné par un microscope confocal. Les eets d'un sténopé à petit diamètre ont été analysés théoriquement sur des faisceaux Laguerre-Gauss d'ordre élevé en polarisation radiale [184]. Dans cette étude nous démontrons, à l'aide de résultats théoriques et expérimentaux sur des nano-sphères et des échantillons biologiques xés avec diérents marqueurs, que l'utilisation des faisceaux Bessel-Gauss en microscopie confocale permet d'en augmenter la résolution d'en- viron ≈ 20%. Ceci n'est possible qu'à condition d'utiliser un sténopé du bon diamètre (une unité d'Airy) pour garder la même distance de travail et rejeter la uorescence provenant des lobes secondaires du faisceau Bessel-Gauss. De plus notre méthode, pour créer un faisceau Bessel-Gauss, ne nécessite pas un état de polarisation spéci que. Cela veut dire que nous pouvons utiliser diérents états de polarisation du faisceau incident pour créer des faisceaux Bessel-Gauss d'ordres diérents. Nous montrons également que les faisceaux Bessel-Gauss ainsi générés sont compatibles avec la technique d'augmentation de résolution SLAM (Switching LAser Modes) présentée en [107].
Ce chapitre se divise comme suit. Nous caractérisons d'abord numériquement nos faisceaux Bessel-Gauss et gaussiens en utilisant la théorie vectorielle de la diraction présentée par Richards et Wolf [185]. Nous comparons ensuite les résultats expérimentaux aux faisceaux théoriques, montrant ainsi l'e cacité de la méthode pour générer des faisceaux Bessel-Gauss en microscopie confocale. Ensuite, nous démontrons l'e cacité des faisceaux Bessel-Gauss pour augmenter la résolution sur diérents échantillons. Puis nous comparons l'utilisation des faisceaux Bessel-Gauss et gaussiens combinée avec la technique SLAM. Finalement, nous montrons que l'utilisation des faisceaux Bessel-Gauss lors de l'acquisition d'images permet de diminuer le taux de faux positifs d'une analyse statistique sur la colocalisation comparé à celui obtenu avec l'utilisation de faisceaux gaussiens.