Dans cette section, nous présentons les résultats de déconvolution sur des acquisitions expé- rimentales eectuées sur un microscope confocal construit par nous-même, avec un objectif à eau d'ouverture numérique NA = 1.2. La longueur d'onde d'excitation est de 532 nm. Le microscope utilisé est celui présenté en section1.2.2.
Méthodes FWHM verticale (nm) FWHM Horizontale (nm)
Confocal 310 ± 10 270 ± 10
SLAM 150 ± 10 120 ± 10
Quad. deconv. TEM00 270 ± 10 140 ± 10
Quad. deconv. TEM00 et TE01 150 ± 10 150 ± 10
Non-quad. deconv. TEM00 160 ± 10 100 ± 10
Non-quad. deconv. TEM00 et TE01 120 ± 10 110 ± 10
Table 2.1 Largeur à mi-hauteur résiduelle de la PSF prise sur l'objet ponctuel pour chaque méthode testée dans les deux directions (verticale et horizontale). Mesures prises sur les don- nées présentées à la g. 2.5et 2.6. Toute les mesures sont données pour une longueur d'onde de 532 nm.
2.4.1 Extraction des PSFs
Pour pouvoir eectuer une déconvolution correctement, il est nécessaire de connaître la PSF avec la meilleure précision possible. Dans le cas présent, la PSF est mesurée sur des échantillons de nano-sphères uorescentes de 100 nm de diamètre. Une image des ces nano-sphères est prise avec un grossissement identique à l'image qui sera traitée. Un algorithme va ensuite détecter les nano-sphères uniques, à partir d'une référence, et les moyenner pour obtenir une mesure non bruitée la plus proche possible de la PSF réelle. L'algorithme1présente les étapes clés du traitement permettant d'extraire la PSF de l'image de nano-sphères.
Algorithme 1 : Extraction de PSF à partir d'image de nano-sphères.
1 Extraction de PSF (I, Ref, p);
Input : Image de nano-sphères I. PSF de référence Ref. Pourcentage de corrélation p Output : PSFexp
2 Calculer une carte de corrélation 2D entre la PSF de référence Ref et l'image I; 3 Binariser la carte de corrélation en fonction du pourcentage p choisi;
4 Éliminer les doublons détectés, chaque point de corrélation représente une PSF détectée; 5 Extraire des images de PSF de I en fonction des points de corrélation;
6 Moyenner les images de PSF extraites de I.
2.4.2 Application sur des échantillons de nano-sphères
Dans cette section, nous avons comparé l'e cacité de la déconvolution multi-images face à la méthode SLAM, en observant des échantillons de nano-sphères uorescentes de 100 nm de diamètre. Ces nano-sphères ont un pic d'absorption à 560 nm et sont placées sur une lamelle de verre avant d'être xées avec un milieu de montage d'indice de réfraction ≈ 1.4 (Fluorescent mounting medium, Dako). Les deux images sont prises successivement avec les deux faisceaux laser TEM00et TE01et ont nécessité un alignement numérique avant traitement
(déconvolution ou SLAM). Le diamètre du sténopé est dans ce cas de 50 µm ≈ 4 AU. Étant donné que les nano-sphères sont dans un plan unique, cela nous permet d'avoir un meilleur signal qu'avec un sténopé de 1 AU.
Confocal SLAM M ulti-img. TEM00 + TE01 1 um deconv.
A
B
C
Figure 2.7 Comparaison expérimentale sur un échantillon de nano-sphères. A] Image confo- cale classique. B] Image SLAM. C] : Résultat de la déconvolution multi-image (TEM00 et
TE01) avec régularisation L2-L1 à préservation de bords. Barre d'échelle : 1 µm.
Vertical Horizontal
A
B
428 855 1283 1711 nm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 534 nm 170 nm 243 nm 97 nm 145 nm 292 583 875 1166 nm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 243 nm 218 nm 97 nm Confocal SLAMNon-quad. deconv.TEM00 & TE01
Figure 2.8 Pro ls pris sur les images de la g. 2.7. A] Pro l vertical. B] Pro l horizontal. Noir : image confocale classique. Vert : image SLAM. Rouge : résultat de la déconvolution multi-images (TEM00 et TE01) avec régularisation L2-L1 à préservation de bords.
Nous constatons, d'après la g.2.7, que la déconvolution nous permet de résoudre deux nano- sphères qui sont normalement non résolues en imagerie confocale classique. En regardant les pro ls à la g. 2.8, nous remarquons clairement l'amélioration apportée par la déconvolution. Le bruit a presque entièrement disparu et la résolution a été grandement augmentée par rapport à l'image initiale (cf g.2.8-A). En comparant les pro ls pris sur les images SLAM et déconvoluées, on a pu conclure que la déconvolution permet d'obtenir une meilleure résolution (cf g. 2.8-A). Cela laisse une PSF résiduelle de largeur à mi-hauteur bien plus faible que la méthode SLAM (cf g. 2.8-B). La largeur à mi-hauteur résiduelle de la méthode SLAM n'est pas aussi bonne que le prédit la théorie car il subsiste des imperfections et une légère asymétrie sur le faisceau TE01 expérimental. Pour que le SLAM puisse fonctionner correctement, le
faisceau TE01a besoin d'être parfaitement symétrique, ce qui n'est pas absolument nécessaire
Une précision est cependant nécessaire : la mesure des PSF pour la déconvolution est eectuée en moyennant plusieures nano-sphères sur une image. Le faisceau laser ayant une largeur à mi-hauteur d'environ 250 nm, une nano-sphère d'environ 100 nm n'augmente pas de manière signi cative la mesure de la PSF (la diérence due à la taille de la nano-sphère est plus petite que la taille de notre pixel). Elle nous permet ainsi une bonne estimation de la PSF.
2.4.3 Application sur des échantillons biologiques
Dans cette section, nous changeons d'échantillon pour nous focaliser sur un marquage en uorescence de microtubules. Les cellules utilisées sont des cellules de cultures de neurones d'hippocampe de rat, xées dans une solution de PFA à 4%. Les microtubules sont ensuite marqués par immunohistochimie (anticorps primaire : monoclonal anti-acetylated -tubulin ; anticorps secondaire : donkey anti-mouse Rhodamine RedX). Les images sont ensuite prises sur le même microscope que précédemment ( g. 1.3) en utilisant l'objectif d'ouverture numérique NA = 1.2 à immersion à eau. Le sténopé a un diamètre de 10 µm ≈ 1 AU.
2-img Deconv. Confocal
1-img Deconv.
SLAM
Confocal
2-img Deconv. TEM00 + TE01
1-img Deconv. TEM00
SLAM 0.7 1.4 2.1 2.8 µm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
A
B
1um TEM00 + TE01 TEM00Figure 2.9 A] Comparaison entre les images confocales, SLAM et déconvolution avec une (TEM00) ou deux images (TEM00et TE01) utilisant la régularisation L2-L1 à préservation de
bords. Barre d'échelle : 1µm. B] Pro ls intégrés de 10 pixels de large sur les lignes présentes en A]. Noir : confocale. Vert : SLAM. Bleu : déconvolution avec une image. Rouge : déconvolution avec deux images.
La g. 2.9 compare les améliorations obtenues avec la méthode SLAM et les déconvolutions à une ou deux images. L'image confocale a été ltrée avec un ltre gaussien de largeur à mi-hauteur de deux pixels pour éliminer le bruit et faciliter la comparaison. Chaque méthode présente clairement une amélioration de résolution et de contraste par rapport à l'image confo- cale. Les images sont présentés à la g. 2.9-A. En regardant sur les pro ls à la g. 2.9-B, on remarque clairement que la déconvolution à deux images ressort clairement car elle permet de
résoudre des structures qui ne sont pas résolues ou à peine visibles avec la déconvolution à une image ou la méthode SLAM.
Nous avons ensuite comparé l'amélioration de résolution sur un autre échantillon où la protéine Gephyrin a été immuno-détectée par un anticorps couplé avec le uorophore mAb7a Oyster 550 ayant un pic d'excitation à 551 nm. Les images ont été prises sur le même microscope que précédement ( g.1.3) avec le même objectif et le même laser. Le sténopé a un diamètre de 10 µm ≈ 1 AU. 0.2 0.3 0.5 0.7 µm 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1um Confocal
2-img Deconv. TEM00 + TE01
1-img Deconv. TEM00
SLAM
B
2-img Deconv. Confocal 1-img Deconv. SLAM TEM00 + TE01 TEM00 ConfocalA
Figure 2.10 A] Comparaison entre les images confocales, SLAM et déconvolution avec une (TEM00) ou deux images (TEM00et TE01) utilisant la régularisation L2-L1 à préservation de
bords. Barre d'échelle : 1µm. B] Pro ls intégrés de 10 pixels de large sur les lignes présentes en A]. Noir : confocale. Vert : SLAM. Bleu : déconvolution avec une image. Rouge : déconvolution avec deux images.
Ici encore, la g.2.10compare les améliorations obtenues avec la méthode SLAM et la décon- volution à une et deux images. L'image confocale a, là encore, été ltrée avec un ltre gaussien de largeur à mi-hauteur de deux pixels pour éliminer le bruit et faciliter la comparaison. Les images sont présentées, en g.2.10-A et les cercles indiquent la zone où les pro ls ont été pris. Le même type d'amélioration qu'en g.2.9est observé ici comme l'illustrent les pro ls à la g. 2.10-B où l'on distingue une structure seulement visible à l'aide de la déconvolution utilisant deux images.
La section suivante présente deux autres faisceaux laser qui peuvent aider la déconvolution à retrouver encore plus de contenu de haute fréquence, et ainsi obtenir des images avec une meilleure résolution. Ces deux faisceaux laser sont les faisceaux Bessel-Gauss d'ordre 0 et 1.