Tests de stabilité du composé 5

En raison des esters éthyliques présentés par les positions 4 et 5 du triazole, le composé 5 est susceptible d’être instable en milieu biologique. Une hydrolyse conduisant à des fonctions acides carboxyliques est très probable. Avant de tester son activité in vivo, nous avons donc souhaité étudier sa stabilité chimique et métabolique.

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3.3.3.1. Stabilité chimique et solubilité

Comme la stabilité de 5 est étudiée en vue de préparer les tests in vivo, nous avons décidé d’utiliser des solutions pouvant servir de véhicules pour les injections chez les animaux. Les résultats de ces tests permettront ainsi à la fois d’évaluer la stabilité chimique de 5 et de mettre au point des conditions expérimentales adaptées à notre composé pour son étude in

vivo.

i. Stabilité chimique de 5

Pour obtenir une évaluation préliminaire de la stabilité chimique de 5, nous l’avons solubilisé dans des solutions composées de PBS (tampon phosphate salin) et de DMA (N,N- diméthylacétamide) : 2,44 mM de 5 dans (PBS/DMA : 97/3). Nous avons ensuite analysé son profil de dégradation, en fonction du temps, par suivi HPLC. Les résultats sont présentés par le diagramme qui suit (Figure 60). Nous remarquons que le temps de demi-vie de 5 dans cette solution est de 3 jours. Notons que le même test a été effectué en protégeant le milieu de la lumière et qu’aucun changement n’a été observé au niveau du profil de dégradation ; la lumière n’induit donc pas d’effet particulier. Comme pour le profil Lipinski-Veber, nous avons souhaité étudier la stabilité de 4, à titre comparatif (Figure 60). Nous observons qu’il se dégrade plus rapidement que 5 (t1/2 = 2 jours vs. 3 jours). De plus, après cinq jours, la quantité

restante de 4 est d’environ 5% tandis qu’elle est de 25% pour 5. Notons, par ailleurs, que cette dégradation ne se produit pas en milieu organique (100% DMSO).

Figure 60 : Stabilité chimique de 4 et 5 dans une solution PBS/DMA : 97/3

0 20 40 60 80 100 120 0 1 2 3 5 4 5 Stabilité de 4 et 5 % de produit restant Jours

95 Nous avons ensuite testé un deuxième véhicule potentiel. Ainsi, 5 a été solubilisé dans une solution de (PBS/DMA : 85/15) à 2,44 mM. Sa dégradation en fonction du temps a été suivie par HPLC. Ceci n’a pas montré d’amélioration au niveau de la stabilité chimique. Le temps de demi-vie de 5 obtenu pour cette nouvelle solution est en effet identique à celui observé pour le premier véhicule (t1/2 = 3 jours). Nous en déduisons que le composé lead 5 devra être mis en

solution juste avant d’être utilisé pour les tests in vivo.

ii. Solubilité aqueuse limitée de 5

Nous avons réalisé des tests de solubilité pour 5 avec différentes combinaisons de PBS/DMA afin de définir un véhicule pour les injections intraveineuses. Idéalement, il faudrait pouvoir injecter à la souris jusqu’à 250 mg/kg soit une concentration de la solution injectable de 62,5 mg/ml de produit. Seulement, nous avons eu des difficultés à concevoir un véhicule qui puisse solubiliser 62 mg/mL du composé 5 sans être toxique. Nous avons donc dû nous limiter à 16 mg/mL. Le véhicule sélectionné pour solubiliser cette quantité est PBS/DMA : 55/45.

3.3.3.2. Stabilité métabolique

La métabolisation d’un composé consiste à le transformer dans le but de faciliter son excrétion. Cette biotransformation se fait suivant deux phases ; la première permet de changer les groupements portés par le composé via des réactions d’oxydations, réductions, hydrolyses, etc. La deuxième phase consiste en l’addition de groupements généralement polaires à la structure du composé en question (ex : acide glucoronique, glutathion, etc.). Ce processus pharmacocinétique constitue un obstacle que le composé actif doit franchir pour pouvoir atteindre sa cible en concentration suffisante. Il est donc primordial d’évaluer la stabilité métabolique d’un candidat médicament avant de passer aux études in vivo. Pour simuler cette métabolisation in vitro, les microsomes de foie sont parmi les modèles les plus communément utilisés car ils présentent un large panel d’enzymes.

Nous avons étudié la stabilité métabolique de 5 en utilisant des microsomes de foie de souris avec le co-facteur NADPH (forme réduite du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate).

96 Résultats

Le pourcentage de produit restant en fonction du temps a été mesuré par HPLC-MS (Figure 61). Nous observons que 5 est rapidement métabolisé et qu’il disparaît totalement à t = 30 min. Le temps de demi-vie a également été mesuré : t1/2 = 1 min.

Figure 61 : Cinétique de la métabolisation de 5 dans les microsomes de foie de souris

Une expérience complémentaire en absence de NADPH a par ailleurs montré que la métabolisation ne dépend pas de ce co-facteur. Ceci peut être interprété de deux façons différentes : soit 5 présente une instabilité chimique indépendante des actions enzymatiques, soit sa métabolisation est bien enzymatique mais n’implique pas le Cytochrome P450.

3.3.3.3. Elucidation des métabolites de 5

Les tests de stabilité chimique et métabolique montrent que 5 se décompose très rapidement. Ceci pourrait signifier que son activité provient d’un dérivé généré suite à une ou plusieurs transformations. Auquel cas, 5 pourrait être considéré comme une pro-drogue.

i. Concept de pro-drogue

L’approche pro-drogue répond à la nécessité d’améliorer les propriétés pharmacologiques de certains composés actifs qui se montrent très peu efficaces in vivo 100. Elle consiste à greffer des groupements labiles permettant de contourner les problèmes de solubilité, perméabilité, biodisponibilité, etc. Ces groupements sont ensuite éliminés par biotransformation pour générer la forme active. Un exemple d’application de cette stratégie est l’amélioration de la perméabilité par masquage de certaines fonctions chimiques (ex : les acides carboxyliques ou les alcools sont masqués par des esters ou des amides).

97 Parmi les pro-drogues commercialisées, le groupement ester éthylique est largement utilisé comme groupement labile. On peut citer les exemples de l’Oseltamivir et du Benazepril dont la perméabilité est améliorée grâce au masquage de la fonction acide carboxylique (Figure 62)

101

. Un autre exemple est présenté par la Docarpamine dont les fonctions phénols sont masquées par des esters éthyliques afin d’optimiser la stabilité métabolique 101 (Figure 62).

Figure 62 : Exemples de pro-drogues portant des esters éthyliques comme groupements labiles

En nous référant à cette approche, on peut suggérer que le composé 5 agit comme une pro- drogue et que ses esters éthyliques sont des groupements labiles servant à masquer des fonctions acides carboxyliques. Etant donné que 5 n’est pas stable dans les microsomes, on peut supposer que ces groupements labiles interviennent en amont des processus métaboliques. Ils pourraient ainsi donner une meilleure perméabilité. Pour étudier cette possibilité, nous avons identifié les métabolites potentiels de 5 par spectrométrie de masse. Nous les avons ensuite synthétisés et avons testé leurs activités antiprolifératives in vitro.

ii. Caractérisation de la décomposition de 5 par LC/MS

L’étude de la stabilité chimique (décrite dans le paragraphe 4.3.1.) a révélé la dégradation de

5 en plusieurs dérivés. Nous nous sommes proposé d’identifier les structures de ces derniers

par LC/MS. L’analyse par HPLC a présenté quatre signaux. Une étude analytique de ces derniers a mis en évidence la présence du substrat 5 et de trois autres produits : le composé 55 qui résulte de l’hydrolyse de l’ester éthylique en position 5, le composé 46 qui provient de la décarboxylation de 55 et le composé 56 dont seul l’ester en position 4 est hydrolysé (Tableau 19).

98 Tableau 19 : Analyse du chromatogramme obtenu suite à la dégradation de 5

Composé tr (min) Aire du pic m/z Structure

5 10,29 3,9% [M+H]+

55 5,50 87,0% [M-28]+

46 5,09 2,1% [M-72]+

56 4,85 2,6% [M-28]+

iii. Synthèse des dérivés de 5

La synthèse des dérivés de 5 identifiés par l’étude LC/MS a ensuite été entreprise. Nous y avons additionné un quatrième dérivé potentiel 57 où les deux esters sont remplacés par des acides carboxyliques. Notons ici que le dérivé comportant un alcyne vrai 46 a déjà été synthétisé. Il appartient à la famille d’analogues III (Cf. paragraphe 3.2.3).

Synthèse des composés 55 et 57

L’hydrolyse de 5 avec la base inorganique faible NaHCO3 a permis de saponifier l’ester

éthylique porté par l’alcyne tout en conservant intact celui en position 4 du triazole. Ainsi le mono-acide carboxylique 55 a pu être préparé avec un rendement de 62% (Figure 63). La saponification des deux esters éthyliques de 5 a quant à elle été réalisée par traitement de ce dernier avec de la soude dans un mélange eau/dioxane. Le diacide correspondant (57) a alors pu être isolé avec un rendement quantitatif.

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Figure 63 : Obtention de 55 et 57 par hydrolyse de 5

Remarquons que l’ester éthylique en position 4 du 1,2,3-triazole s’est montré plus stable que celui en position 5, en milieu basique ; le dérivé mono-acide (57, Tableau 19) n’a donc pas pu être isolé.

iv. Evaluation de l’activité des dérivés de 5

Après leur synthèse, les dérivés 55 et 57 ont été testés pour leurs activités antiprolifératives sur la lignée de LMC K562 en utilisant la technique XTT. Les résultats de ces tests sont présentés sous forme de CI50 (Tableau 20). L’activité de 46, présentée au niveau du

paragraphe 3.2.3.3, est représentée ici. Nous observons une activité faible pour chacun des trois dérivés. Ce résultat donne lieu à deux hypothèses différentes : soit aucun de ces produits ne présente la forme active de 5, soit l’un d’eux est bien la forme active mais est doté d’une perméabilité membranaire médiocre.

Tableau 20 : Activités antiprolifératives des métabolites potentiels de 5 Produit final 46 55 57

CI50 (µM) >10 >10 >10