3. Chapitre 3
3.5. Mode d’action de 5
Parallèlement aux études in vivo Rappelons ici que cette thèse avait
contre les hémopathies myéloïdes LMC et SMD original : induction de la mort autophagique
collaborateurs se sont ainsi intéressés prioritairement au t réalisé de nombreux tests à cette fin.
3.5.1. Tests enzymatiques
Les protéases sont des enzymes qui hydrolysent la liaison peptidique. Suivant leur mécanisme catalytique, elles sont subdivisées en six familles
glutamiques, métallo, à sérine, à thréonine constituée par les protéases à cystéine
impliquées dans la régulation et l’exécution de l’ tests de biologie cellulaire pour
protéases à cystéine, nous comptons également L…) qui interviennent aussi
cathepsines sont des enzymes prot catalytiques et qu’il en existe
citées), cathepsines à serine (A et G) cathepsines aspartiques (D et E).
: Evolution du poids en présence des différents traitements
5
in vivo, nous nous sommes intéressés au mode d’action de
que cette thèse avait pour objectifs a) L’optimisation de l’activité de l’ACA contre les hémopathies myéloïdes LMC et SMD. b) La conservation de son mode d’action
induction de la mort autophagique. En se penchant sur le mode d’action, n se sont ainsi intéressés prioritairement au type de mort cellulaire induite. Ils
à cette fin. Nous présentons ici les résultats les plus importants.
Les protéases sont des enzymes qui hydrolysent la liaison peptidique. Suivant leur mécanisme subdivisées en six familles : protéases aspartiques,
glutamiques, métallo, à sérine, à thréonine (Figure 66). La famille la plus important protéases à cystéine qui incluent les caspases. Ces dernières étant impliquées dans la régulation et l’exécution de l’apoptose, sont largement utilisées
pour mettre en évidence un mode d’action apoptotique. , nous comptons également certaines cathepsines (ex
dans l’étude des mécanismes apoptotiques. Précisons que les des enzymes protéolytiques lysosomales qui diffèrent par leurs domaines
en existe par conséquent différents types : cathepsines à cystéine cathepsines à serine (A et G) cathepsines aspartiques (D et E).
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: Evolution du poids en présence des différents traitements
mode d’action de 5. l’activité de l’ACA de son mode d’action En se penchant sur le mode d’action, nos ype de mort cellulaire induite. Ils ont ons ici les résultats les plus importants.
Les protéases sont des enzymes qui hydrolysent la liaison peptidique. Suivant leur mécanisme ses aspartiques, à cystéine, plus importante est Ces dernières étant apoptose, sont largement utilisées dans les un mode d’action apoptotique. Parmi les : cathepsines B, C, l’étude des mécanismes apoptotiques. Précisons que les rent par leurs domaines : cathepsines à cystéine (déjà
Aspartique Cysteine Cathepsine D et E Napsine A Cathepsines Caspases Calpain Figure
Résultats des tests :
Afin d’identifier le type de mort cellulaire induite (Cathepsines B et L et caspases 3 et 9)
mesurées après stimulation de cellules K562
quatre expériences réalisées pour ces enzymes montrent qu présence du composé 5 (Figure
par 5 repose, au moins partiellement, sur un mécanisme apoptotique
Figure 67 : Mesure de l’activité de certaines
Protéases
Cysteine Glutamique Métallo Serine Threonine
CathepsinesB, C, H, K, L, O, S, X
Caspases1-14 Calpain 1-14
Figure 66 : Classification des protéases 102
type de mort cellulaire induite par 5, les activités de certaines (Cathepsines B et L et caspases 3 et 9) impliquées dans le processus apoptotique
de cellules K562 avec ce composé et incubation
quatre expériences réalisées pour ces enzymes montrent qu’elles sont toutes activées en (Figure 67). Ce résultat semble indiquer que la mort cellulaire induite repose, au moins partiellement, sur un mécanisme apoptotique.
Mesure de l’activité de certaines protéases « apoptotiques » en présence de
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Threonine
de certaines protéases dans le processus apoptotique ont été avec ce composé et incubation pendant 48h. Les sont toutes activées en la mort cellulaire induite
104
3.5.2. Etude par électrophorèse
Afin d’explorer davantage le mode d’action de 5, nos collaborateurs ont étudié via des expériences de western-blot l’influence de ce composé lead-optimisé sur l’expression de trois marqueurs de mort cellulaire.
3.5.2.1. Protéines étudiées
LC3- Marqueur d’autophagie : La protéine LC3 (microtubule-associated protein 1 light
chain 3, Atg8 chez la levure) est considérée comme un marqueur autophagique. Cette dernière
peut se présenter sous deux formes distinctes : LC3-I et LC3-II. Le passage de la forme précurseur LC3-I à la forme activée LC3-II se produit suite au déclenchement de l’autophagie, afin d’assurer la formation de l’autophagosome.
PARP- Marqueur d’apoptose : La protéine PARP (Poly(ADP-Ribose)Polymerase) est une
enzyme nucléaire qui catalyse la formation d’un polymère d’ADP-ribose en réponse aux cassures de l'ADN. Elle est substrat de la caspase 3. Cette dernière étant un effecteur de l’apoptose, l’observation du statut de PARP est considérée comme un marqueur apoptotique.
HSP60- Marqueur de nécrose : En plus de l’apoptose et de l’autophagie, il existe un
troisième type de mort cellulaire : la nécrose. Contrairement aux deux premiers processus qui sont génétiquement codés pour se déclencher dans certaines conditions, la nécrose est une mort cellulaire accidentelle. Elle survient notamment pour les cellules lésées à la suite d’une infection. Afin de déclencher une réponse inflammatoire, ce processus libère des protéines endogènes telles que la protéine de choc thermique HSP60, d’où l’utilisation de cette dernière comme marqueur de la nécrose.
3.5.2.2. Résultats du test
L’observation du statut de chaque marqueur a été effectué avec : un contrôle (DMSO seul), le composé 5 après 24 et 48h d’incubation à la dose de 1 µM (Figure 68). Nous remarquons pour le marqueur autophagique (LC3) et le marqueur apoptotique (PARP) que leurs expressions s’intensifient entre 24 et 48h en présence de 5. A l’inverse, nous n’observons pas de changement d’expression pour la protéine de choc thermique HSP60 entre le contrôle et les
105 échantillons stimulés par le composé lead. Ces résultats semblent indiquer que la mort cellulaire induite par 5 implique à la fois les mécanismes d’apoptose et d’autophagie mais qu’elle n’inclut pas la nécrose.
Figure 68 : Etude de la mort cellulaire induite par 5 par électrophorèse