Elucidation de la cible moléculaire

La biotine est une molécule de petite taille (244,31 g.mol-1) connue pour sa forte interaction avec la streptavidine, un homotétramère de 56 kDa. En plus de sa très haute affinité (constante d’association : ka = 1015 M-1), le complexe streptavidine-biotine est caractérisé par sa

spécificité et sa résistance à différentes conditions expérimentales (agents dénaturants, dégradation enzymatique, PH extrêmes) 106,107. Pour ces raisons, il est largement utilisé en biochimie et biologie moléculaire.

Identifier une cible moléculaire par utilisation du système biotine-streptavidine

Parmi les applications de ce système, on trouve l’isolement et la purification de macromolécules d’intérêt 106. Ainsi, pour identifier la cible d’un composé actif donné, on peut greffer à sa structure une molécule de biotine, avant de l’injecter au milieu biologique. L’échantillon est ensuite purifié via un support chromatographique portant la streptavidine. La grande affinité et spécificité biotine-steptavidine, permet d’éliminer par lavages toutes les protéines, excepté celle liée au composé biotynilé. Le complexe protéique est ensuite dissocié et la protéine-cible est isolée afin d’être identifiée.

Synthèse du composé biotinylé

Pour élucider la (les) cible(s) moléculaire(s) de nos composés lead 78 et 91, nous avons eu recours à ce système biotine-streptavidine, en synthétisant un dérivé conjugué biotine-78. Nous avons décidé d’ancrer le motif biotine au pharmacophore en position para du noyau benzyle, comme pour la formation des composés fluorescents (Figure 87).

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4.3.3.1. Première approche visant à former le composé biotinylé

Pour obtenir le composé biotinylé, nous avons utilisé une première approche rétro-synthétique en déconnectant la biotine du fragment bras espaceur- pharmacophore (Figure 88).

Figure 88 : Première approche rétro-synthétique visant à former le produit biotinylé

Ainsi, nous avons suivi le chemin réactionnel décrit ci-dessous (Figure 89). Une première étape consiste à coupler l’acide carboxylique porté par le composé 101 à l’amine libre du composé 98. Ce couplage peptidique a donné un très bon rendement (92%) grâce à l’activation préalable de l’acide carboxylique en chlorure d’acyle. La déprotection du tert- butylcarbamate de l’intermédiaire 108 donne le produit 109 qui suit une réaction tandem cycloaddition-couplage oxydatif. Malheureusement, ceci ne donne pas le produit désiré ; une dégradation de 109 est en effet observée. Ce résultat peut être expliqué par une chélation potentielle exercée par l’amine libre sur le complexe cuivreux.

Figure 79 : Première approche synthétique visant à former le produit biotinylé

4.3.3.2. Deuxième approche visant à former le composé biotinylé

La première approche ayant échoué à former le produit biotinylé, nous avons essayé une deuxième stratégie rétro-synthétique (Figure 90). Comme la réaction tandem cycloaddition- couplage oxydatif s’est montrée sensible aux groupements pouvant jouer le rôle de ligands, nous nous sommes proposé de l’effectuer en dernier. Nous avons donc envisagé de coupler le

134 bras espaceur à la biotine et au pharmacophore avant de former le triazole, de sorte à ce qu’il n’y ait pas d’amine libre lors de la réaction tandem.

Figure 90 : Deuxième approche rétro-synthétique visant à former le produit biotinylé

Pour appliquer cette stratégie, nous avons suivi le chemin réactionnel décrit ci-dessous (Figure 91). Nous commençons par un couplage type peptidique entre la biotine et le 1,3- diaminopropane mono-N-protégé 98, ce qui donne l’intermédiaire 110 avec un rendement de 34%. Ce dernier est ensuite déprotégé à l’aide de l’acide trifluoroacétique pour donner le composé 111, avec un rendement quantitatif. Un couplage peptidique entre l’intermédiaire

111 et le synthon 101 est subséquemment suivi mais le produit attendu n’est malheureusement

pas formé.

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4.3.3.3. Troisième approche visant à former le composé biotinylé

Comme ces approches linéaires n’ont pas permis de former le produit biotinylé, nous avons décidé de suivre une stratégie rétro-synthétique convergente. Ainsi, nous avons choisi la liaison peptidique entre le bras espaceur et le pharmacophore comme point de déconnexion. Les deux synthons obtenus (synthons 1 et 2, Figure 92) devaient donc être préparés séparément et couplés lors de la dernière étape de synthèse.

Figure 92 : Rétro-synthèse convergente pour la formation du composé biotinylé

Préparation du synthon (1)

Le couplage de la biotine au 1,3-diaminopropane mono-N-protégé 98, effectué dans le cadre de la deuxième stratégie de synthèse (paragraphe 3.3.2), a donné un rendement assez faible (34%). Pour la préparation du synthon (1), nous avons donc décidé de pré-activer l’acide carboxylique porté par la biotine avant de passer au couplage. Le N-hydroxysuccinimide a donc été inséré (Figure 93). Ceci a donné l’intermédiaire 112 avec un rendement de 95%. L’ester porté par 112 est ensuite déplacé par l’amine libre 1,3-diaminopropane mono-N- protégé 98, donnant le composé 113 avec un rendement de 78%. Enfin, 113 a été déprotégé par l’action de l’acide trifluoroacétique pour donner le synthon (1).

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Figure 93 : Préparation du synthon 1

Préparation du synthon (2)

L’acide carboxylique du composé 101 a été activé par l’addition du N-hydroxy-succinimide, en vue du couplage peptidique avec le synthon (1). Le composé 114 a ainsi été formé avec un rendement de 95%. Ce dernier a ensuite suivi la réaction tandem cycloaddition-couplage oxydatif pour obtenir le synthon (2) avec un rendement non optimisé de 10%.

Figure 94 : Préparation du synthon (2)

Couplage des synthons (1) et (2)

Le couplage entre l’amine du synthon (1) et l’acide activé du synthon (2) (Figure 95) a donné un résultat préliminaire encourageant : l’analyse du brut réactionnel par LC-MS a permis de mettre en évidence la présence du composé biotinylé 115. Comme cette méthodologie convergente s’est montrée viable, elle sera réutilisée avec des quantités plus importantes des synthons (1) et (2). Ceci permettra d’isoler le composé 115, de le caractériser et de l’utiliser afin d’élucider la (les) cible(s) moléculaire(s) des composés lead non nucléosidiques 78 et 91.

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