L’association à l’enveloppe des chloroplastes des protéines 140K/98K a été démontrée en condi- tion d’infection virale (Jakubiec et al., 2004). Nous proposons que les hélices alpha amphipa- thiques du DAC puissent être non seulement responsables de l’adressage, mais également de l’ancrage des protéines 140K/98K au niveau de la membrane externe de l’enveloppe des chloro- plastes.
La structure des protéines et les propriétés physico-chimiques de leurs acides aminés influencent leurs interactions avec les constituants des membranes cellulaires. Les protéines peuvent être d’une part extrinsèques ou périphériques et, d’autre part, intrinsèques ou intégrales (Figure 1. 11) (Alberts B et al., 2002).
Les protéines extrinsèques peuvent être liées par des interactions électrostatiques ou des liaisons physiques non-spécifiques de force faible, directement avec la bicouche lipidique, ou indirecte- ment via une protéine déjà associée à la membrane (Figure 1. 11 7 et 8). Des traitements chi- miques par augmentation du pH ou de la force ionique vont permettre de dissocier cette catégo- rie de protéines de la membrane.
Parmi les modifications co- ou post-traductionnelles des protéines, certaines consistent en la pré- nylation, myristoylation ou palmitoylation d’acides gras, ou en l’ajout d’un groupement lipidique covalent de type glycosyl-phosphatidylinositol (GPI) (Parmryd et al., 1997; Running, 2014; Stael et al., 2011). De par leur nature, ces acides gras et ancres GPI (Figure 1. 11 1, 5 et 6) sont ensuite insérés dans la membrane cellulaire ciblée. La protéine n’est pas dissociable de la membrane par augmentation du pH ou de la force ionique.
Quant aux protéines intrinsèques ou intégrales, elles sont insérées dans la membrane traversant la bicouche lipidique grâce à ses domaines transmembranaires (Figure 1. 11 1 et 2) ou ses feuillets β disposés en barils (Figure 1. 11 3). Il est également possible que la protéine soit insérée unique- ment dans l’une des couches de la membrane grâce à des hélices amphipathiques (Figure 1. 11 4). En effet, des interactions ont lieu entre les queues hydrophobes des lipides membranaires et les acides aminés hydrophobes, ainsi qu’entre les têtes polaires de ces lipides et les acides aminés chargés positivement. Ces protéines intégrales ne peuvent être décrochées des membranes par augmentation du pH ou de la force ionique. Seul l’emploi de détergents appropriés permet de les solubiliser (Alberts B et al., 2002).
Afin de définir le mode d’interaction des protéines 140K/98K avec les membranes intracellu- laires, nous avons travaillé à partir de feuilles de chou infectées par le TYMV, afin d’obtenir une plus grande quantité de matériel biologique qu’avec des protoplastes infectés. Lors de l’infection virale, la polyprotéine 206K est clivée en ses produits : la protéine 140K et la polymérase (66K). La protéine 140K, clivée en protéines 98K et hélicase, est présente en quantités extrêmement faibles (Jakubiec et al., 2004). Les fractions membranaires ont été extraites de feuilles de chou infectées, puis soumises à divers traitements chimiques pour trouver les conditions de solubilisa- tion des protéines 98K et 66K. Les membranes traitées ont ensuite été sédimentées par ultracen- trifugation permettant de récolter les fractions membranaires et solubles, puis de rechercher par western blots la présence des protéines 98K et 66K (Figure 1. 12). Ces expériences ont été réali- sées au laboratoire par Stéphanie DEVIGNOT.
En l'absence de traitement (H2O seul), les protéines 98K et 66K sont retrouvées exclusivement
au niveau du culot de membranes (Figure 1. 12, puits 1 et 2). Comme témoins de solubilisation, nous avons choisi de traiter les membranes soit au SDS 2 %, soit avec le polyoxyéthylène éther W1 (ou lubrol W1) 0,5 %. Le SDS, détergent ionique, entraîne la dénaturation des protéines et dissocie la bicouche lipidique. Par ce traitement, les protéines se retrouvent bien dans la fraction soluble (Figure 1. 12, puits 11 et 12). Contrairement au SDS, le lubrol est un détergent non- ionique qui préserve l’intégrité membranaire tout en permettant l’extraction des complexes de réplication viraux fonctionnels (Deiman et al., 1997; Jakubiec et al., 2004). Les protéines 98K et 66K sont effectivement retrouvées dans la fraction soluble suite aux traitements avec ce détergent (Figure 1. 12, puits 13 et 14).
Afin de tester si la protéine 98K est dépendante des forces électrostatiques pour son interaction avec les membranes, celles-ci ont été incubées avec des concentrations élevées de sels (NaCl 1 M et KCl 1 M, puits 3 à 6 sur la Figure 1. 12), ou de composés fortement basiques (Na2CO3 0,2 M
et NaOH 0,2 M, puits 7 à 10 sur la Figure 1. 12). La protéine 98K est insensible aux traitements salins et alcalins car elle reste associée aux fractions membranaires.
Ces résultats montrent, d’une part, que la protéine 98K n’est pas une protéine périphérique - son interaction n’est pas uniquement dépendante d’éventuelles forces électrostatiques - et, d’autre part, qu’elle présente les caractéristiques d’une protéine intégrale membranaire.
En ce qui concerne la protéine 66K, nous observons que les traitements salins (puits 3 à 6, Figure 1. 12) ne permettent pas sa dissociation des membranes, même partielle, contrairement aux trai- tements avec les composés basiques (puits 7 à 10, Figure 1. 12). Il a déjà été démontré que les complexes de réplication du TYMV sont hébergés par des structures vésiculaires invaginées si- tuées à la périphérie de l'enveloppe du chloroplaste (Prod’homme et al., 2001) et que la protéine 66K interagit physiquement avec la protéine 98K (Jakubiec et al., 2004). Cette protection par les membranes invaginées pourrait donc empêcher l’accessibilité des complexes de réplication aux traitements salins. En revanche, les traitements basiques convertissent les formes vésiculaires des membranes en feuillets, rendant accessibles les complexes de réplication, et permettent donc la dissociation des interactions entre les protéines 66K et 98K. Ces résultats signifient que les com- plexes de réplication sont protégés de l’environnement cytoplasmique, probablement grâce à l’ancrage de la protéine 98K dans les membranes de l’enveloppe externe des chloroplastes.
Ces expériences de solubilisation de la protéine 98K ont été réalisées en condition d’infection virale, faisant intervenir tous les facteurs viraux. Afin de s’affranchir de leur présence, nous avons initié des tests de solubilisation avec des protoplastes transfectés avec le pΩ-EGFP-140K. Les résultats préliminaires obtenus vont dans le sens de ceux observés en condition virale, signifiant que la seule protéine virale impliquée à la fois dans l’adressage et l’ancrage serait la protéine 140K, contenant les protéines 98K et hélicase. Cependant ces tests préliminaires n’ont pas été poursui- vis, du fait des trop faibles quantités de matériel disponibles avec les protoplastes transfectés.
5 Le repliement du DAC en hélices amphipathiques est nécessaire pour la
réplication virale
Parmi les protéines 140K mutantes fusionnées à la GFP que nous avons créées, deux ne sont plus adressées aux chloroplastes et se retrouvent localisées dans le cytoplasme : 140K AB LPLP et 140K AB ILLL/AAAA. Afin de déterminer la contribution du phénomène d’adressage dans la réplication du TYMV, nous avons introduit les mutations responsables de la perte de l’adressage dans le génome viral.