Afin de s’assurer que l’absence de réplication observée avec les transcrits des mutants E17- stop69K ne soit pas liée à son incapacité à interagir avec la polymérase virale 66K, nous avons entrepris de vérifier que les protéines 140K/98K et 66K sont toujours capables d’interagir entre elles en utilisant la technique de complémentation de fluorescence bi-moléculaire (BiFC).
La technique de BiFC (Hu et al., 2002) a été adaptée pour les plantes (Walter et al., 2004) et per- met de visualiser des interactions entre protéines à l’intérieur des cellules vivantes. Elle consiste à fusionner chacune des deux protéines candidates à l’interaction, avec la partie N-terminale de la YFP pour l’une et avec la partie C-terminale de la YFP pour l’autre. En cas d’interaction des deux protéines candidates, les parties N- et C-terminales de la YFP se retrouvent alors suffisamment proches pour permettre l’assemblage complet et irréversible de la YFP, conduisant à l’observation d’un signal fluorescent. En revanche, si les deux protéines candidates ne sont pas suffisamment rapprochées (jusqu’à environ 10 nm, comme estimé par Hu et al., 2002), alors la YFP n’est pas formée.
Il a été montré que les protéines 140K et 66K sont impliquées dans une interaction protéine- protéine, impliquant le domaine protéase de la protéine 140K (Jakubiec et al., 2004). Or, celui-ci étant également présent dans la protéine 98K, nous avons vérifié que les protéines 66K et 98K peuvent interagir, en employant des vecteurs d’expression où les parties N- ou C-terminales de la YFP sont fusionnées à ces protéines. Les mutations AB LPLP et AB ILLL/AAAA ont ensuite été introduites dans les vecteurs pNter-YFP-98K et pCter-YFP-98K. A titre de témoins négatifs de l’expérimentation, nous avons également testé l’interaction entre la 98K et trois protéines cel- lulaires : la succinate déshydrogénase 5 (SDH5), la tata-binding protein 1 (TBP1) et une petite protéine ribonucléaire (IMPA) qui sont fusionnées à la partie C-terminale de la YFP dans le pCter-YFP. Des protoplastes d’A. thaliana ont ensuite été co-transfectés avec les plasmides
pNter-YFP-98K (sauvage ou mutantes) et pCter-YFP-66K ou p-Cter-YFP- SHD5, TBP1 ou IMP4. A 48 h p.t., une fraction des cellules a été analysée par cytométrie en flux pour quantifier le pourcentage de cellules fluorescentes, reflétant donc la proportion de cellules présentant des inte- ractions (Figure 1. 14A). Une autre fraction des cellules a été observée en microscopie confocale à spinning disk (Figure 1. 14B) afin de détecter la localisation subcellulaire des protéines en inte- raction.
A B Nter-YFP- 98K WT + Cter-YFP- 66K Signal YFP : 6,41 % Nter-YFP- 98K WT + Cter-YFP- IMP4 Signal YFP : 0,19 % Nter-YFP-98K- AB-LPLP + Cter-YFP- 66K Signal YFP : 3,56 % Nter-YFP-98K- AB-ILLL/AAAA + Cter-YFP- 66K Signal YFP : 4,04 %
Figure 1. 14 –Analyses des interactions entre protéines 98K et 66K par BiFC.
Les protéines testées sont mentionnées à gauche de chaque condition. (A) Données issues de l’analyseur Cyan pour les tests de BiFC où R6 désigne la zone présentant des cellules avec un signal YFP significatif après compensation. A droite est indiquée la proportion de cellules ayant un signal YFP (%). (B) Visualisa- tion en protoplastes d’A. thaliana des interactions pour les protéines testées. Images de microscopie con-
focale à spinning disk, sur un plan de la cellule, au grossissement 100X. Le marquage jaune correspond à la fluorescence de la YFP et le magenta aux fluorescences de la chlorophylle et de la NirFP. Barre d’échelle : 10 µm.
L’emploi de la cytométrie en flux permet de détecter un signal YFP significatif et de donner les proportions de cellules ayant un signal fluorescent (R6, Figure 1. 14A). Nous observons que les cellules co-exprimant les protéines 98K sauvage et 66K présentent un signal YFP pour 6,41 % des cellules.
Les observations de ces co-transfections en microscopie confocale permettent de déterminer la localisation de la fluorescence de la YFP, résultante des interactions entre les protéines 98K et la polymérase 66K. Des images représentatives de ces co-transfections (Figure 1. 14B) montrent que les protéines 98K sauvage et 66K interagissent en périphérie des chloroplastes, confirmant les résultats antérieurs (Jakubiec et al., 2004).
Les résultats de cytométrie en flux attestent que la protéine 98K n’interagit pas avec les protéines cellulaires choisies comme témoins négatifs (sur la Figure 1. 14, seule l’interaction 98K-IMP4 est représentée). Le signal YFP visible en microscopie correspond à du bruit de fond.
En ce qui concerne les protéines 98K mutantes, les données issues de la cytométrie en flux révè- lent que 3,5 % des cellules pour Nter-YFP-98K-AB LPLP et 4 % des cellules pour Nter-YFP- 98K-AB ILLL/AAAA présentent un signal YFP significatif (Figure 1. 14A).
L’observation des cellules en microscopie confocale a permis de visualiser le signal YFP dans le cytoplasme des cellules, ce qui est cohérent avec la localisation cytoplasmique des deux protéines mutantes EGFP-140K-AB LPLP et EGFP-140K-AB ILLL/AAAA (respectivement, Figure 1. 8F et Figure 1. 9F).
Ces résultats nous permettent de conclure que les deux protéines mutantes localisées dans le cy- toplasme sont toujours capables d’interagir avec la polymérase virale 66K. Le défaut de réplica- tion virale observé précédemment n’est donc pas causé par une interaction défectueuse entre les deux partenaires (Figure 1. 13).
A
B
C
Figure 1. 15 – Comparaisons des méthyltransférases des réplicases virales du supergroupe des alphavirus.
(A) organisation des domaines réplicases des groupes « alto » et « tymo ». Les représentations sont ap- proximativement à l’échelle et présentent les résultats de l’étude d’Ahola et Karlin (2015) ainsi que nos résultats pour le TYMV. Les génomes de plusieurs membres du supergroupe des alphavirus codent pour une polyprotéine, qui est clivée en plusieurs protéines, ou qui est exprimée en protéines individuelles, comme illustré par le Sindbis virus et le TYMV, et le Brome mosaic virus, respectivement. Au contraire, la
réplicase du Bamboo mosaic virus n’est pas clivée. Pour chaque virus, seuls des protéines ou domaines conte-
nant une MTase-GTPase, une protéase, une RdRp ou une triphosphatase sont indiqués. Les segments impliqués dans une association avec les membranes (mb) sont indiqués, les putatifs présentent un point d’interrogation.
(B) Organisation de la région Core des MTase-GTase. La représentation est approximativement à l’échelle. Les hélices alpha et les brins β sont indiqués par des rectangles et flèches, respectivement. Le résidu chargé (R^ ou E^), dans l’hélice αA, est localisé 7 acides aminés en aval de l’histidine H♠ et les deux cystéines (C*) en amont de βC sont espacées de 6 acides aminés. Les éléments de structure secondaire ou les posi- tions qui ne sont pas strictement conservés sont indiqués par des crochets.
(C) Organisation de la région Iceberg, en aval de la région Core des MTase-GTase, qui débute après le résidu conservé Y♦ dans le brin βG. Les conventions sont les mêmes qu’en (B).
Figure adaptée d’après Ahola et Karlin (2015)
6 Discussion du chapitre
6.1 Importance des hélices alpha amphipathiques pour l’association membra-