Tests enzymatiques

VIII.1 Spectrophotométrie stop-flow.

Plusieurs techniques permettent de mesurer l’activité enzymatique de la CA. La plus ancienne consiste à évaluer son activité estérasique.¹⁸⁷ L’utilisation d’un substrat, tel que l’acétate de p-nitrophényle, permet par spectrophotométrie de suivre son hydrolyse et par conséquent l’activité de la CA.

Pour ces travaux de thèse, il a été utilisé une méthode par spectrophotométrie dite

stop-flow. Celle-ci permet de déterminer indirectement l’activité enzymatique de la CA par

l’étude de variation du pH via l’utilisation d’indicateur coloré. En effet, les CAs catalysent la réaction d’hydratation du dioxyde de carbone en générant du bicarbonate et un proton qui va acidifier le milieu. Cependant, lors de l’addition d’un inhibiteur potentielle, cette catalyse est compromise tout comme la libération du proton.

La technique stop-flow permet de mélanger rapidement deux solutions (Figure 48). La première est composée de l’indicateur coloré et de l’enzyme avec ou non la présence de l’inhibiteur. La seconde est une solution saturée de dioxyde de carbone. Par la suite, le pH du mélange est suivi par mesure de l’absorbance à l’aide d’une cellule photosensible UV-visible.

Figure 48 : Spectrophotométrie stop-flow.

Ces mesures, à différentes concentrations, permettent de calculer en pourcentage l’activité de la CA en faisant le rapport de l’activité en présence de l’inhibiteur sur celle en l’absence de l’inhibiteur. Enfin, à l’aide de l’équation de Cha,¹⁸⁸ la constante d’inhibition (K_I) est déterminée à partir de lC50 (concentration qui permet d’inhiber de moitié l’activité enzymatique) préalablement calculée.

Tous les tests d’inhibition ont été effectués par l’équipe du Pr. Claudiu T. Supuran de l’Université de Florence.

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VIII.2 Résultats des tests enzymatiques.

Des tests d'inhibition enzymatique in vitro ont été faits pour comparer la puissance inhibitrice des composés monovalents et multivalents précédemment synthétisés. Pour cela, différents types d'isoformes de l'anhydrase carbonique sont choisis en fonction de leurs pertinences d'un point de vue physiologique et pathologique:

· 2 isoformes cytosoliques, la hCA I et la hCA II

· 4 isoformes transmembranaires et/ou associées à des tumeurs, la hCA VII, hCA IX et la hCA XII.

· 1 isoforme secrétée, la hCA IV

Les résultats de ces tests sont rapportés dans le tableau 5 pour les composés obtenus en série oxime.

Ki [nM]^[a]

Composé hCA I hCA II hCA IV hCA VII hCA IX hCA XII cyRAFT(CHO)4 32 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 liRAFT(CHO)4 34 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 > 10000 42 63 250 392 > 10000 36 652 35 89 19 81 > 10000 421 > 10000 Pr 0.7 13.2 4.8 n/a 0.1 n/a Pr/n 0.18 3.3 1.2 n/a 0.02 n/a 36 55 51 608 > 10000 481 - Pr 1.2 4.9 0.6 n/a 0.1 - Pr/n 0.3 1.2 0.15 n/a 0.02 -

Tableau 5 : Résultats des tests d’inhibition enzymatique sur la CA des plateformes

cyRAFT(CHO)4 32, liRAFT(CHO)4 34, du composé monovalent oxime 42 et des conjugués

multivalents oxime 35 et 36.

6 mesures ont été prises sur chaque composé. [a] Marge d’erreurs de ±10% sur les valeurs rapportées.

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Tout d'abord, les peptides cyRAFT(CHO)₄ 32 et liRAFT(CHO)4 34 seuls ont été testés

et aucun impact sur l'inhibition n’a été observé. Ce premier test met en évidence la neutralité de la composition de ces systèmes peptidiques sur l'inhibition. Par la suite, on remarque que le composé monovalent 42 inhibe fortement et avec une sélectivité assez marqué l'isoforme hCA IX avec une constante d'inhibition (K_I) égale à 36 nM.

Concernant les conjugués multivalents 35 et 36, une inhibition plus faible a été constatée sur les isoformes IX et XII de l'anhydrase carbonique comparée à l'inhibiteur monovalent. Cependant, une amélioration de la puissance d'inhibition du système multivalent cyclique 35 est observée sur la hCA II et IV (Tableau 1). Dans ce cas, la puissance relative (Pr) augmente et elle est respectivement de 13 à 5 fois supérieures. De plus, si on se focalise seulement sur la hCA II, un effet multivalent positif est mis en évidence en calculant la puissance relative par inhibiteur de sulfonamide (Pr/n) avec une augmentation jusqu'à 3,3 fois supérieure pour le conjugué cyclique 35 toujours comparé à l'inhibiteur 42.

D'un point de vue structural, si l'on compare les deux types de systèmes multivalents utilisés, ici le conjugué cyclique 35 et le linéaire 36, une baisse de la puissance inhibitrice sur toutes les isoformes, exceptée la hCA I, est mise en évidence avec le système 36 qui est le plus flexible en terme d'organisation structurale.

Pour la série acylhydrazone les résultats des tests d'inhibition enzymatique sont recensés dans le tableau 6.

Ki [nM]^[a]

Composé hCA I hCA II hCA IV hCA VII hCA IX hCA XII

43 48 618 811 97 9 817 37 329 53 80 34 100 103 Pr 0.1 11.7 10.1 2.8 0.1 7.9 Pr/n 0.02 2.9 2.5 0.7 0.02 1.9 38 460 89 428 75 10 938 Pr 0.1 6.9 1.9 1.3 0.9 0.9 Pr/n 0.02 1.7 0.5 0.3 0.2 0.2

Tableau 6 : Résultats des tests d’inhibition enzymatique sur la CA du composé monovalent acylhydrazone 43 et des conjugués multivalents acylhydrazone 37 et 38.

6 mesures ont été prises sur chaque composé. [a] Marge d’erreurs de ±10% sur les valeurs rapportées.

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Les résultats obtenus sur cette série sont sensiblement similaires à ceux de la série oxime précédemment testée. Comme pour le composé monovalent 42, une excellente inhibition est remarquée pour le conjugué monovalent 43 sur la hCA IX avec une constante d'inhibition égale à 9 nM et avec une bonne sélectivité parmi les isoformes testées. De la même façon, des effets multivalents positifs sont observés avec le conjugué cyclique 37 sur les isoformes hCA II, IV mais également sur la hCA XII avec une puissance relative par inhibiteur supérieure à 1. Enfin, le conjugué multivalent constitué du peptide cyclique (composé 37) montre aussi ici une puissance améliorée par rapport au conjugué multivalent linéaire 38.

Les inhibitions obtenues avec les composés monovalents, en série oxime et (acyl)hydrazone, mettent en évidence la spécificité et la forte affinité de ces petites molécules à inhiber l’isoforme IX de l’anhydrase carbonique. Au contraire, l’utilisation de ces mêmes composés sur des plateformes multivalentes permet de moduler l’affinité et la sélectivité de ces inhibiteurs avec des effets multivalents positifs sur les isoformes II et IV de l’anhydrase carbonique. L’existence d’un site de liaison secondaire sur ces isoformes, déjà rencontré lors de précédents travaux, pourrait expliquer ce phénomène.¹⁸⁹ Cependant, il n’est pas impossible qu’un effet d’agrégation entre en jeux, ce qui pourrait favoriser certaines isoformes qui ont la capacité de se regrouper favorablement sur le système multivalent.

Ces résultats montrent également des différences structurelles liées à la nature de la plateforme (cyclique ou linéaire) ayant un effet intéressant sur la puissance de ces inhibiteurs de la CA. Le fait que les conjugués pré-organisés 35 et 37 montrent une meilleure puissance d’inhibition par rapport aux conjugués 36 et 38 semble indiquer que l'ajustement structurel entre les différentes isoformes de la CA et l'inhibiteur multivalent joue un rôle important. Ainsi, il est possible que les effets statistiques soient à l'origine des effets multivalents observés ici et opèrent grâce à une augmentation de la concentration locale des inhibiteurs de la CA. En effet, la structure cyclique permet d’arborer dans la même direction les quatre inhibiteurs de quoi favoriser la concentration locale d’inhibiteurs à proximité du site actif.

IX. Conclusion

Dans cette partie, quatre inhibiteurs multivalents de l'anhydrase carbonique ont été synthétisés avec leurs analogues monovalents. Les systèmes utilisés pour apporter cette multivalence sont des châssis peptidiques sous deux formes. Le premier est cyclique et permet d'avoir une préorganisation structurale au niveau des inhibiteurs et le second est un peptide linéaire beaucoup plus flexible. Ces systèmes peptidiques ont été fonctionnalisés avec des aldéhydes glyoxyliques de telle sorte à faciliter l'insertion des inhibiteurs sur les plateformes par simple ligation oxime ou acylhydrazone.

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Les essais d'inhibition enzymatique ont révélé des effets multivalents positifs intéressants se produisant spécifiquement sur un couple d'isoforme (hCA II et hCA IV). Des effets structuraux ont également été démontrés sur l'inhibition des isoformes de la CA avec une amélioration de la puissance d'inhibition via l'utilisation du système cyclique qui est le plus organisé.

Cette étude a permis de mettre en évidence l'intérêt de l'utilisation de systèmes multivalents organisés. En effet, dans ces travaux le peptide cyclique, composé de quatre inhibiteurs de l'anhydrase carbonique, a permis de moduler l'inhibition et la sélectivité sur les différents isoformes. Cependant, les effets obtenus peuvent être encore augmenté par d'autres travaux. Ici seulement deux inhibiteurs de type sulfonamide ont été utilisés, ainsi il serait donc judicieux d'en synthétiser un plus large panel. Par exemple, l’utilisation de coumarines, qui sont très sélectives vis-à-vis des isoformes transmembranaires hCA IX et XII serait, une voie intéressante à explorer afin d’augmenter la modulation de la sélectivité. Des problèmes de solubilité ont également été rencontrés lors de la ligation, là aussi des travaux sur les chaines latérales du peptide pourraient, à la fois, être une solution pour augmenter la solubilité des inhibiteurs multivalents formés, mais aussi des éléments d’informations supplémentaires sur la relation structure-activité en modifiant leurs longueurs. Enfin, seule la face dite "inhibitrice" a été utilisée dans ce projet, il serait intéressant à l'avenir de mettre à profit l'autre face dite "effectrice" du cyclopeptide afin d'incorporer un fluorophore pour faire de l'imagerie et/ou un radiosensibilisateur à but thérapeutique (Figure 49).