Synthèse des plateformes peptidiques

Le décapeptide cyclique cyRAFT(CHO)4 32 et son analogue linéaire liRAFT(CHO)4 34

ont été synthétisés sur support solide (Figure 46). Ces deux peptides arborent quatre fonctions aldéhydes glyoxyliques obtenues par coupure oxydante de quatre résidus de Sérine incorporés sous la forme d’un dipeptide Lysine-Sérine dans la séquence peptidique. (cf. III.5.1)

Figure 46 : RAFT cyclique cyRAFT(CHO)4 32et RAFT linéaire liRAFT(CHO)4 34.

V.1 Synthèse du dipeptide 26

Dans un premier temps le dipeptide 26 est synthétisé, celui-ci permettra d’obtenir les ramifications du peptide cyclique avec, en bout de chaine, les fonctions aldéhydes glyoxyliques (Schéma 13). Cependant, comme dit précédemment, cette fonction est très

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réactive et, pour ne pas l’altérer, il est nécessaire quelle soit masquée jusqu’ à la fin de la synthèse des RAFTs. Pour cela, la L-Sérine protégée par un groupement tert-butoxy carbonyle sur la position N-terminale et un groupement tert-butyl sur l’alcool de la chaine latérale est utilisée. La synthèse du dipeptide 26 se fait en deux étapes. La première consiste à activer la position C-terminale de la sérine à l’aide du N-hydroxysuccinimide (NHS) en présence du dicyclohexylcarbodiimide (DCC) afin de former l'ester activé correspondant 25. Il est alors couplé à la chaine latérale de la Fmoc-L-Lys-OH en présence de diisipropyléthylamine (DIEA) afin d’obtenir le composé 26 avec un rendement de 98%.

Schéma 13 : Synthèse du dipeptide 26 Fmoc-Lys-(Ser(Otbu)-Boc).

V.2 Synthèse des peptides sur SPPS

Le dipeptide 26 a été incorporé dans la synthèse sur support solide du décapeptide qui se fait de manière automatisée. De par la stratégie de synthèse choisie (Fmoc/tBu), la résine 2-chlorotrityl (bille de polystyrène fonctionnalisée par des groupements 2-chlorotrityl) est utilisée comme support solide. Cette résine permet de cliver le peptide en fin de synthèse à l’aide d’une solution d’acide trifluoroacétique à 1% (TFA) et donc de conserver les groupements protecteurs acido-sensibles sur les chaines latérales. De plus, l’encombrement stérique généré par les groupements trityles réduit les risques de formation de dicétopipérazine au cours de la synthèse (Schéma 14). Le premier acide aminé greffé est le Fmoc-Gly-OH afin d’éviter la racémisation du fait de l’absence de chaine latérale. Il est couplé manuellement à la résine pour augmenter le rendement car une mauvaise incorporation de celui-ci a été observée lors de la synthèse automatisée.

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Le greffage se fait donc en présence d’un agent de couplage, l’hexafluorophosphate de 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium (HBTU) et d’une base, la N, N-diisopropyléthylamine (DIEA) dans le DMF (Schéma 15). La résine 27 est alors obtenue avec une charge de 0.31 mmol/g de résine. Par la suite, l’incorporation des neufs autres acides aminés se fait de façon automatisée, de l’extrémité C-terminale vers l’extrémité N-terminale, par une succession de cycle de déprotection et de couplage. Chaque couplage peptidique est effectué en 5 min à 70°C assisté par micro-ondes en présence de 3 équivalents de HBTU et 5 équivalents de DIEA. Cependant, le deuxième et le troisième acide aminé sont couplés à température ambiante toujours pour éviter la formation de dicétopipérazine. L'élimination des groupements Fmoc des positions N-terminale est effectuée par traitement de la résine avec une solution de pipéridine à 20% dans le DMF. Lors de cette déprotection, l’adduit dibenzofulvènepipéridine est généré et permet par une mesure de l’absorbance en UV à 299 nm, d’évaluer le taux d’incorporation des acides aminés au cours de la synthèse. En fin de synthèse le décapeptide 28 greffé à la résine est obtenu.

Schéma 15 : Synthèse sur support solide automatisée du décapeptide 4.

V.3 Synthèse du RAFT cyclique

Le décapeptide 28 est ensuite clivé de la résine en présence de TFA à faible concentration (0,1% de TFA dans le dichlorométhane) afin de conserver les groupements protecteurs tert-butyl carbonyle et tert-butyl sur les amines et les alcools des résidus de Sérine en bout de chaine. Le peptide linéaire 29 est obtenu par précipitation dans l'éther diéthylique et après purification par HPLC en phase inverse avec un rendement global de 43 % (Schéma 16).

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Schéma 16 : Synthèse du RAFT cyclique cyRAFT(CHO)₄ 32.

Par la suite, une étape de cyclisation a lieu en condition très diluée, à 0.5mM du composé 29, afin de favoriser la cyclisation intramoléculaire. Le peptide cyclique 30 est de nouveau obtenu après précipitation dans Et2O avec un rendement quantitatif et ceci est certainement du à la pré-organisation du peptide 29 en solution qui permet de faciliter la cyclisation. La déprotection des groupements tert-butylcarbonyle et tert-butyl se fait par acidolyse dans une solution de TFA à 95% dans l’eau et en présence d’un piégeur, le triisopropylsilane (TIS). Le peptide cyclique 31 totalement déprotégé est isolé avec un rendement 71%. Enfin, le raft cyclique cyRAFT(CHO)₄ 32 est obtenu par oxydation des

résidus de Sérine en bout de chaine en présence de NaIO4. V.4 Synthèse du RAFT linéaire

Le peptide linéaire liRAFT(CHO)4 34 est lui aussi obtenu à partir de l’intermédiaire de

synthèse 28. Avant d’être clivé de la résine, celui-ci est acétylé sur la position N-terminale en présence d’anhydride acétique (Schéma 17). Ensuite, à l’aide d'une solution de TFA/TIS/H2O (95/2.5/2.5) il est à la fois clivé de la résine et déprotégé sur ces chaines latérales afin d’obtenir le composé 33 avec un rendement de 56%. Enfin, de la même manière que pour le peptide cyclique, en présence de NaIO4 les résidus de Sérine en bout de chaine sont oxydées pour obtenir les fonctions aldéhydes glyoxyliques présentes sur la plateforme peptidique linéaire liRAFT(CHO)4 34 avec un rendement de 47 %.

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Schéma 17 : Synthèse du RAFT linéaire liRAFT(CHO)4 34.