Chapitre IV : Développement de nanomatériaux de silice pour le ciblage des anhydrases
V. Méthodologie de synthèse du POSS T 8 fonctionnalisé par des aldéhydes glyoxyliques
V.6 Ligation
Exp. Calc. (**) POSS(52) 2825 217 82 83 1.2 POSS(53) 2488 202 80 81 1.2 POSS(54) 1328 156 75 76 1.3
(*) La température de début de dégradation est prise à 5% de perte de masse (**) La perte de masse est calculée en considérant le SiO2 comme résidu final.
Tableau 10 : Résultats de l’ATG des POSS 52, 53 et 54.
V.6 Ligation
En parallèle de la purification du POSS(CHO)8 54 portant les fonctions aldéhydes glyoxyliques, des tests de ligation en un seul pot, oxydation puis ligation, ont été effectués. Afin de mettre en place la méthodologie, la méthoxyamine a été choisi comme ligand. Ainsi, l’oxydation du POSS-(NH2-L-Ser(OH)-OH)8 53 est effectuée directement dans une solution d’eau avec 0,1% de TFA qui permet la formation de la liaison oxime. Après 3 heures de réaction, suite à l’oxydation, du bisulfite de sodium (NaSO3H) est ajouté au milieu réactionnel permettant la réduction et donc la neutralisation de l’excédant de NaIO4 utilisé. Il est important de neutraliser le NaIO4 puisque celui-ci peut oxyder par la suite les fonctions oxyamine ou hydrazide utilisées lors de la ligation (Schéma 35).
Schéma 35 : Formation du POSS 55 multiconjugué en un seul pot.
Par la suite, huit équivalents (soit 1 équivalent par position d’aldéhyde) de méthoxyamine sont additionnés au milieu réactionnel. Enfin, après 24 heures, la solution est lyophilisée puis repris dans le D2O afin d’être analysée par RMN du proton. L’analyse montre seulement la présence du POSS 54 aldéhyde et de la méthoxyamine. L’hydrate à 5,2 ppm encore présent confirme la présence de l’aldéhyde sur le POSS et donc que la ligation n’a pas eu lieu. Des tests avec 16 et 32 équivalents de méthoxyamine avec des températures allant de 50 à 100°C ont également été effectués sans obtenir de résultats.
130 | P a g e
La ligation en un seul pot n’a pas fait l’objet de plus de recherche et a été stoppée dès lors ou le POSS(CHO)8 54 a pu être isolé après dialyse. Le solide obtenu après dialyse et lyophilisation a été solubilisé dans l’eau avec 0.1% de TFA à une concentration de 10mM. Par la suite, 10 équivalents de méthoxyamine ont été ajoutés à la solution (Schéma 36).
Schéma 36 : Formation du POSS 5 multiconjugué.
Après seulement 3 minutes, un précipité blanc apparait. La solution est alors centrifugée et le filtrat est ensuite retiré. Le solide blanc obtenu est lavé trois fois à l’eau puis séché sous vide. Enfin, il est repris dans du DMSO-d6 pour être analysé en RMN du proton (Figure 76).
131 | P a g e
L’analyse montre la présence de la liaison oxime grâce au singulet situé à 7,5 ppm qui correspond au proton de la double liaison. L’analyse par Maldi-Tof montre que les huit positions ont bien été substituées par la méthoxyamine avec, notamment, la détection de l’adduit [POSS 55+Na]+ (Figure 77). Enfin, l’analyse par RMN29Si a permis de valider la compatibilité entre les conditions utilisées pour la ligation et la conservation de la cage.
Figure 77 : MALDI-ToF du composé POSS 55.
La méthodologie de ligation a également été effectuée à partir d’un hydrazide pour former la liaison (acyl)hydrazone. Pour cela, le ligand utilisé est l’inhibiteur benzosulfonamide hydrazide 8 synthétisé au cours du chapitre 2 (Schéma 37).
Schéma 37 : Formation du POSS 56 multiconjugué.
La réaction est effectuée à 10mM dans un tampon acétate de sodium à pH 5 en présence de 10 équivalents du ligand 8. Après 3 minutes, le précipité formé est centrifugé puis lavé trois fois à l’eau. Ainsi, le POSS 56 décoré avec l’inhibiteur 8 de l’anhydrase carbonique a été isolé avec un rendement de 14%. Les analyses par RMN1H, 29Si et Maldi-ToF
132 | P a g e
confirment la formation de la liaison (acyl)hydrazone, la substitution des huit positions aldéhydes par l’hydrazide et que la cage n’a subit aucune hydrolyse.
V.6 Conclusion
Dans cette partie, une méthodologie de synthèse a été mise en place afin de synthétiser un POSS T8 totalement inédit portant huit fonctions aldéhydes glyoxyliques. La synthèse de ce composé a été effectuée en seulement 3 étapes avec, tout d’abord, la formation de la liaison amide entre le POSS octaaminopropyl et d’un dérivé de la L-Sérine. Puis s’en est suivie une étape de déprotection en milieu acide pour former le POSS aminoalcool correspondant. Enfin, les aldéhydes glyoxyliques en bout de chaines, ont pu être formés après une étape d’oxydation. Afin d’isoler POSS(CHO)8 54 des sels présents lors de l’oxydation, différentes approches et techniques de purifications ont été employées. La plupart d’entre elles n’ont pas été compatibles et ont favorisé l’hydrolyse de la cage. Seule la dialyse a permis d’isoler le POSS(CHO)8 54 sans engendrer d’hydrolyse. La réactivité de ce composé, hautement soluble dans l’eau, a été testée vis-à-vis d’oxyamine et d’hydrazide pour former les liaisons oxime et (acyl)hydrazone correspondantes. Il a été démontré par RMN du 1H et par Maldi-ToF que les huit positions avaient été substituées et que les conditions utilisées pour la ligation permettaient de conserver la cage totalement condensée.
Enfin, malgré qu’il soit hygroscopique, le POSS(CHO)8 54 a pu être synthétisé à l’échelle du gramme et peut être conservé sous argon à 0°C à l’état solide ou en solution dans l’eau pendant plus d’un mois.
Ainsi une nouvelle plateforme octavalente fonctionnalisable par bioconjugaison oxime ou (acyl)hydrazone a pu être synthétisée via une voie de synthèse rapide, simple et avec de très hauts rendements.
Ces résultats encourageants ont permis d’amorcer des nouveaux projets basés sur la synthèse de nanoparticules structurées et fonctionnalisées par des aldéhydes glyoxilique pour la bioconjugaison. Ainsi on peut envisager de synthétiser des POSS T12 ou T4 qui peuvent apporter de nouvelles propriétés structurales et avec une valence différente (Figure 78).
133 | P a g e