Tension de bord dans des membranes d’EggPC

La majorité des données de tensions de bord présentées dans la lit- térature ayant été collectées sur des vésicules d’EggPC, nous avons tout d’abord testé notre méthode sur des GUVs de cette composition. Comme

indiqué précédemment, nous avons vérifié sur des vésicules d’EggPC mar- quées à la Rhodamine PE, par microscopie à fluorescence à l’aide d’une caméra rapide EMCCD, qu’un macropore unique était bien créé sur le pôle de la vésicule faisant face à la cathode (cf figure 5.2). Ceci confirme les observations précédentes réalisées avec des vésicules de DOPC [Tekle 01, Portet 09], et indique que ce comportement ne dépend pas des queues hy- drophobes mais qu’il est peut-être dû au groupe polaire PC des lipides considérés. Dans un petit nombre d’expériences, on pouvait aussi voir un macropore côté anode, mais cette partie de la vésicule abritant aussi la nu- cléation de tubules, nous avons préféré concentrer notre analyse sur les macropores côté cathode. Pour les GUVs étudiés, de rayons allant de 10 à 40 µm, les impulsions utilisées induisaient des différences de potentiel de l’ordre de 0.8–1.25 V. Nous avons pu clairement suivre la fermeture du pore en microscopie à contraste de phase, comme le montre la figure 5.1. La première image montre la vésicule encore non perturbée par l’impulsion. Pendant l’impulsion, i.e. pendant les 5 premières millisecondes, les vé- sicules adoptaient un forme sphéro-cylindrique, avec leur axe de symétrie dans la direction du champ (voir par exemple la figure 5.4B), comme rap- porté auparavant pour des GUVs dans des solutions salées [Riske 06]. Les déformations étaient moins prononcées dans nos expériences, vraisembla- blement à cause de nos champs de plus faible amplitude, mais duraient plus longtemps en raison de nos impulsions plus longues.

Les pores pouvaient être détectés après environ 5 ms, quasiment à la fin de l’impulsion. Les résolutions temporelle et spatiale de notre dispositif ne nous ont pas permis de détecter la formation et la croissance du pore de manière précise. Il semblait que le pore était créé avec un rayon as- sez grand de l’ordre de quelques microns, grandissait légèrement pendant les quelques centaines de microsecondes suivantes, se stabilisait au cours des quelques millisecondes subséquentes, puis entamait son régime de fermeture lente. Cette séquence typique d’évènements se produisait pour la quasi-totalité des liposomes étudiés, et ce pour toutes les compositions. Il est encore peu clair si le processus de poration était initié avec un seul macropore créé pendant l’impulsion, ou si plusieurs petits pores étaient formés avant de coalescer juste après l’impulsion. Si le premier scénario est valide, la vitesse d’ouverture du macropore devrait être de l’ordre de plusieurs mm/s, i.e. au-delà de notre résolution. Nous penchons plu- tôt en faveur de la seconde hypothèse avec plusieurs pores de très petite taille car le potentiel critique de poration est déjà atteint au tout début de l’impulsion.

Concentrons-nous maintenant sur l’étape (iii) de fermeture lente utili- sée pour la mesure des tensions de bord. Les images de la figure 5.1B-F

correspondent à cette phase, et les images de la figure 5.1G, H montrent la vésicule après fermeture totale du pore. L’image prise après 25 ms, à la figure 5.1B, montre que la membrane du GUV est aussi altérée face à l’anode. Il a déjà été rapporté que cet hémisphère abritait la nucléation de petits pores [Tekle 01] et la génération de tubules [Portet 09], ce qui, outre le fait qu’on n’observait pas systématiquement de poration côté anode, constitue un argument contre l’analyse de la fermeture du pore sur cet hémisphère. La fermeture avait d’ailleurs lieu beaucoup plus rapidement: ce côté du liposome semble intact sur les images suivantes.

Afin d’illustrer la procédure de traitement des images conduisant à la mesure précise du rayon du pore décrite en annexe B.1, nous montrons dans les deuxième et quatrième colonne de la figure 5.1 l’allure des images après traitement correspondant au côté cathode du GUV figurant sur les images adjacentes. Le cercle externe blanc correspond à la frontière entre le halo lumineux entourant la vésicule et le fond gris, alors que le cercle interne indique la position de la membrane. C’est ce cercle interne qui est donc utilisé pour mesurer le rayon r des pores comme indiqué sur la figure 5.1E.

Les GUVs, en général, rétrécissaient à cause de l’impulsion électrique. Ce comportement est cohérent avec celui décrit au chapitre 4 et dans [Portet 09], mais remet en question l’hypothèse R=cte utilisée pour dériver l’équation 5.6. Or, nous avons vu au chapitre précédent que nous avons pu établir que cette décroissance de taille probablement liée à l’éjection de petites vésicules ou de tubules avait lieu majoritairement dans les quelques centaines de microsecondes suivant l’impulsion, et que lors du régime (iii) la diminution de taille du liposome était quasi-inexistante. L’approximation

R =cte durant le régime (iii) est donc bel et bien fondée pour notre système, et nous devons donc utiliser pour la mesure de la tension de bord γ la valeur de R mesurée après fermeture du pore.

Après avoir mesuré sur les images l’évolution de la taille du pore, nous traçons dans la figure 5.5 avec des cercles gris la taille de la région du pore caractérisée par R2ln(r)en fonction du temps, pour 6 expériences typique- ment représentatives des 41 expériences réalisées sur les GUVs d’EggPC. Les lignes pleines noires sont des droites d’ajustement conformes à l’équa- tion 5.6. La tension de bord γ est déduite de la pente de ces droites, qui semblent logiquement parallèles étant donné que la composition membra- naire des GUVs est identique. Pour ces membranes d’EggPC, nous trouvons comme valeur moyenne de γ 14.2 pN, avec une erreur standard de 0.7 pN ; voir la table 5.2 pour des valeurs de la tension de bord d’EggPC trouvées dans la littérature.

lange partiel des sucres. Si la perte de contraste associée n’était pas trop importante, nous utilisions encore la même vésicule pour effectuer d’autres mesures de γ, et ainsi confirmer la reproductibilité des résultats. Dans ce cas de figure, les impulsions étaient bien séparées dans le temps, par envi- ron 5 minutes. Le total de 41 expériences sur les bicouches d’EggPC a été réalisé sur 16 vésicules distinctes, provenant de différentes préparations.