7.2.1
Expériences d’électropulsation
De l’iodure de propidium (PI) et de l’ADN plasmidique marqué avec une sonde fluorescente, le TOTO-1, ont été utilisés pour étudier la perméabi- lisation de la membrane par champs électriques et l’entrée de molécules associée. La perméabilisation était induite par l’application d’impulsions électriques de durée 20 ms et d’amplitude 50 kV/m, à une fréquence de répétition de 1 Hz. Ce protocole est connu pour provoquer à la fois la per- méabilisation de la membrane, et le transfert de gène [Golzio 02]. La per- méabilisation de la membrane était observée au niveau de la cellule unique, à une résolution temporelle de 500 images par seconde. Cette fréquence d’acquisition autorisait le suivi du processus de l’entrée de molécules à la fois pendant et après les impulsions, avec une résolution spatiale typique de microscopie confocale. Un intérêt particulier a été porté à l’entrée de molécules ayant lieu après une unique impulsion, ou après une dizaine.
7.2.2
Expériences d’électropulsation en présence de PI
Comme on peut le voir sur les figures 7.1A et 7.1C, et comme déjà rap- porté dans [Golzio 02], la perméabilisation de la membrane était détectée par entrée de PI, face aux deux électrodes. L’afflux de PI dans les cellules, déduit de la fluorescence associée, suggère un transport libre à travers
la membrane vers le cytoplasme ; on n’observe pas de piégeage dans le voisinage de la membrane. L’entrée de PI commençait au moment de l’ap- plication du champ électrique, et la concentration de PI dans la cellule augmentait pendant environ une minute, montrant que l’état perméable de la membrane persiste après la fin de l’impulsion (figure 7.1E). En effet, la majorité des molécules pénétrait dans la cellule après l’impulsion. L’ana- lyse de l’infiltration des molécules image par image révéla que le processus était à la fois asymétrique et différé: il était plus important face à l’anode et retardé de 4–5 secondes face à la cathode. Cette asymétrie de transport peut s’expliquer par le fait que le PI en solution porte une charge électrique de +2e et que la force électrophorétique l’entraîne vers la cathode.
7.2.3
Expériences d’électropulsation en présence d’ADN
L’électrotransfert d’ADN dans les cellules CHO a donné des résultats ra- dicalement différents de ceux obtenus pour l’électrotransfert de PI. L’inter- action ADN/membrane n’a été observée que pour des intensités de champ électrique plus grandes que la valeur critique (∼25 kV/m) induisant la per- méabilisation, i.e. conduisant à une entrée de PI. Dans le régime de faibles champs, l’ADN s’écoulait simplement autour des cellules et se dirigeait vers l’anode. Pour des champs perméabilisants, on n’observait pas comme pour le PI une entrée diffuse d’ADN pendant ni même après l’impulsion. On observait en revanche une accumulation sur des sites distincts de la membrane perméabilisée faisant face à la cathode (figure 7.1D). Les molé- cules d’ADN semblaient s’agréger sur ces sites, et ce dès le déclenchement de l’impulsion électrique (figures 7.2A et 7.2B). De manière surprenante, ni le nombre ni la taille apparente de ces sites ne semblaient augmenter avec le nombre d’impulsions appliquées. Pendant l’application d’une impulsion, la fluorescence des sites augmentait linéairement avec le temps, indiquant que la quantité d’ADN piégé augmentait aussi linéairement (figure 7.1F). Comme cette même fluorescence n’augmentait pas en l’absence de champ électrique, nous pouvons conclure que l’accumulation d’ADN sur les sites d’interaction est principalement de nature électrophorétique.
La présence de sites stables, sièges de l’interaction ADN/membrane, était observée sur l’ensemble de la population cellulaire (figure 7.1D). La distance moyenne entre un site et son plus proche voisin était de l’ordre de 1 µm, et le diamètre d’un site de l’ordre de 300–600 nm (borne inférieure due à la limite de diffraction). Comme le montre la figure 7.2C, la quantité totale d’ADN dans la région de la membrane croissait proportionnellement au nombre d’impulsions. La quantité finale d’ADN dans la région de la membrane était corrélée à la quantité d’ADN atteignant le noyau de la cel-
lule, comme estimé par le taux d’expression de la GFP entre 2 et 24 heures après l’électrotransfection (figure 7.3).
Comme on peut le voir sur les figures 7.1E et 7.1F, une large proportion de l’ADN restait fixée au site d’interaction après la fin de l’impulsion. Ceci pourrait être dû à une véritable interaction entre l’ADN et la membrane plasmique, ou bien au fait que l’ADN poussé par la force électrophoré- tique à travers la membrane soit virtuellement immobile dans la cellule en l’absence de champ électrique. Cette dernière observation montre que l’interaction ADN/membrane pourrait être causée, du moins en partie, par l’accumulation électrophorétique et une mobilité de l’ADN réduite à l’inté- rieur de la cellule dans la région du pore.
La mobilité des complexes d’ADN formés sur les sites d’interaction a aussi été étudiée, en mesurant le coefficient de diffusion latérale des spots par expériences de FRAP. Les résultats ont montré qu’aucun échange d’ADN entre les sites ou avec le milieu externe n’avait lieu, et que l’ADN était totalement immobile à l’échelle de temps de l’expérience, son coef- ficient de diffusion latérale étant inférieur à 10−16m2s−1. Ce pourrait être expliqué par la mobilité réduite des molécules d’ADN à l’intérieur de la cellule, ou parce que le molécules d’ADN forment des agrégats immobiles à cause de leur grande taille. Il est peu probable que cette immobilité soit due à une immobilité intrinsèque des pores, étant donné que la valeur me- surée pour le coefficient de diffusion est largement plus faible que celles typiquement rapportées dans la littérature pour des objets membranaires, tels que des protéines par exemple.
On pourrait prétendre qu’une polymérisation de l’actine autour des sites riches en ADN pourrait être responsable de leur immobilisation, ainsi que de la migration consécutive dans le cytoplasme. Cependant, la per- turbation du cytosquelette d’actine par incubation des cellules avec de la Latrunculine A n’a pas semblé modifier les caractéristiques des spots d’ADN, leur création, leur stabilité ou leur immobilité (figure 7.4). Ceci im- plique que même si l’actine peut causer une importante diminution de la mobilité de gros fragments d’ADN dans le cytoplasme, la formation initiale des spots d’ADN et leur immobilité ne sont pas dues au réseau d’actine.