4.1 L’impact des composants dermiques sur la réponse de l’épiderme au stress UV
4.1.3 Les techniques alternatives pour étudier l’influence du derme sur la réparation
Pour cette analyse approfondie, on serait tenté d’utiliser un modèle plus simple, plus rapide et moins coûteux que les peaux reconstruites, comme un modèle de co-culture à l’aide d’un transwell ou encore l’utilisation de milieux de culture conditionnés par des feuillets de fibroblastes pour cultiver des kératinocytes. À cette fin, nous avons analysé l’impact sur l’efficacité de la NER de la co-culture de feuillet de fibroblastes avec des kératinocytes dans un transwell. Les transwells sont des supports perméables permettant de garder une culture cellulaire au-dessus d’une autre dans un même pétri. Ce montage permet d’observer uniquement l’effet des molécules sécrétées, en ayant un milieu de culture commun mais aucun contact physique entre les deux types cellulaires. Lors de nos études de réparation des CPD dans des kératinocytes en co-culture, nous n’avons pas trouvé d’effet positif de la co-culture sur la vitesse d’élimination des dommages (Figure 4.4). De même, nous avons analysé cette efficacité de réparation dans des kératinocytes cultivés avec un milieu de culture conditionné par des feuillets de fibroblastes. Le milieu de culture conditionné, est le milieu de culture dans lequel les feuillets de fibroblastes ont été cultivés pendant 24 h. Il contient donc des molécules sécrétées par ces fibroblastes. Mais à nouveau, nous n’avons pas vu de différence de réparation entre les kératinocytes cultivés dans du milieu conditionné et les kératinocytes contrôles cultivés sur du plastique avec un milieu de culture standard (Figure 4.4). L’absence d’impact positif de la co-culture et des milieux conditionnés par les fibroblastes, nous a amené à nous demander si cette absence d’effet était due au
fait que les fibroblastes n’étaient pas exposés aux rayons UVB. Nous nous sommes donc demandé si le transwell pouvait bloquer les rayons UV qui arrivent aux fibroblastes. Pour répondre à cette question, nous avons mesuré et calculé la transmission des rayons UVB par le transwell et avons découvert que seule une infime partie des rayons UVB utilisés pour irradier les kératinocytes est transmise par le transwell (Figure 4.5). Donc dans cette expérience, comme dans le cas du milieu conditionné, les fibroblastes ne sont pas ou très faiblement exposés aux rayons UVB. Nous avons alors posé l’hypothèse que l’irradiation des fibroblastes était essentielle pour que ceux-ci sécrètent des signaux de réparation aux kératinocytes. Nous pourrions répondre à cette hypothèse, en co-cultivant des fibroblastes et des kératinocytes et en les irradiant tous deux aux rayons UVB avant d‘analyser la réparation des CPD épidermiques.
Figure 4.4 Cinétique de réparation des CPD dans des kératinocytes cultivés
dans du milieu de culture conditionné ou en co-culture avec des feuillets de
fibroblastes.
Des kératinocytes ont été cultivés avec du milieu de culture conditionné par des feuillets de fibroblastes ou en co-culture, à l’aide d’un transwell, avec des feuillets dermiques. Des kératinocytes cultivés sur plastique avec un milieu de culture standard servent de contrôle. Les 3 modèles ont été irradiés avec 400 Jm-2 d’UVB et les kératinocytes ont été récoltés 0,
6, 12, 24 et 48h après l’irradiation. Les cellules non exposées ont servi de contrôle négatif et le niveau de CPD à T=0 était considéré comme 100% de dommage. Nous n’observons pas de différence significative d’efficacité de réparation des CPD entre les 3 conditions de culture des kératinocytes. L’expérience a été faite pour chaque condition en duplicata sur 3 cultures de kératinocytes.
Figure 4.5 Spectre de transmission de la lumière UVB filtrée ou non par le
transwell utilisé pour la co-culture.
La transmission de la lumière par le transwell a été mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre UV–visible (Varian Cary. 50 Bio UV–visible spectrophotometer) et multipliée par le spectre d’émission de la lampe UVB afin d’obtenir le spectre de transmission du transwell. Le spectre d’émission de la lampe UVB seule a été dérivé des spécifications du fabricant et modifié en fonction de mesures effectuées avec un spectrophotomètre à double monochromateur International Light (IL7000 × 760D × 790).
Selon ces spectres, nous pouvons constater que le transwell bloque une grande majorité des rayons UVB, ainsi qu’une partie des rayons UVA.
L’absence de contact physique entre les kératinocytes et les feuillets dermiques est une seconde différence entre les modèles de peaux reconstruites et ceux de co-culture et de milieu conditionné. Ces contacts physiques pourraient eux aussi jouer un rôle important dans la communication dermo-épidermique en réponse aux rayons UV. En effet, la MEC contribue à diverses fonctions biologiques grâce à sa capacité à se lier à de nombreux partenaires tels que d'autres protéines de la MEC, des cytokines, des facteurs de croissance, des récepteurs et des molécules d'adhésion (Hildebrand et al., 1994, Kim et al., 2011, Whitelock et al., 2008).
Finalement, le fait que l’on ne puisse pas reproduire nos résultats d’accélération de la réparation des CPD UVB-induits dans les peaux reconstruites sur des modèles plus simples démontre toute l’importance de garder un modèle relativement complexe pour effectuer un premier criblage de molécules sécrétées par le derme, qui pourraient impacter la réparation des CPD épidermiques.
4.1.4 La mort cellulaire
Dans l'épiderme humain, l'apoptose est un processus essentiel qui, associé à la prolifération et à la différenciation assure l'homéostasie du tissu. C’est également un des trois mécanismes de protection cellulaire contre les dommages induits par les rayons UV, avec l’arrêt du cycle cellulaire et la NER. Il a été décrit dans plusieurs études que les fibroblastes dermiques et les cytokines qu’ils sécrètent pouvaient avoir un impact sur l’apoptose des kératinocytes ((Fernandez et al., 2014) et revue dans (Schwarz and Schwarz, 2009)). Ces médiateurs affectent la mort cellulaire de façon variée, par exemple, l’Interleukine-1 (Il-1) augmente l'apoptose (Kothny-Wilkes et al., 1999), alors qu’Il-12 et Il-23 réduisent l'apoptose induite par les rayons UV dans les kératinocytes (Majewski et al., 2010, Schwarz et al., 2002). Afin de compléter notre analyse sur les différentes réponses de l’épiderme au stress UV-induit, il serait donc intéressant d’évaluer l’impact du derme et de CXCL5 sur ce deuxième mécanisme de protection des kératinocytes qu’est la mort cellulaire induite par les rayons UV.